DNA transformation et Genie génétique

La transformation de cellules eucaryotes par du DNA consiste à cloner en présence d'un DNA porteur d'un gène précis, des cellules obtenues à partir de tissus permettant d'obtenir des lignées cellulaires en culture in vitro.
La transfection de cellules eucaryotes par du DNA viral d'origine animale ou végétale, a pour objectif l'augmentation de l'efficacité du transfert du DNA dans les cellules. Le DNA viral peut s'intégrer dans le DNA cellulaire sous forme de provirus et donne à la cellule de nouveaux caractères, comme l'induction de tumeurs.
La transformation de cellules eucaryotes par fusion cellulaire donnant des hybridomes (cellules hybrides), est un autre moyen de transfert de gènes d'une cellule à une autre. Après plusieurs générations, les cellules hybrides peuvent perdre certaines parties du génome (chromosomes,...) et donnent lieu à des phénotypes différents où certains gènes peuvent être localisés sur des chromosomes précis.
La transformation de cellules eucaryotes par microinjection de DNA dans le noyau cellulaire permet le transfert de gènes qui s'intègrent de façon stable dans le génome de cellules maintenues en culture.

2.6. CLONAGE D'UN GENE
La recombinaison in vitro d'un DNA porteur de gènes qui seront clonés dans des cellules est une des technologies de base du génie génétique. Quatre étapes principales peuvent être distinguées dans la purification d'un gène par génie génétique. Elles concernent les sources du DNA à cloner, l'insertion du DNA dans un vecteur, le clonage du DNA recombiné dans une cellule en culture et l'identification du clone cellulaire ou du virus contenant le DNA recombinant.

2.6.1. SOURCES DU DNA SUJET AU CLONAGE
DNA de synthèse chimique: le principe consiste à relier des nucléotides d'enchaînement connu en fixant un trinucléotide sur un support comme le sépharose et en ajoutant d'autres trinucléotides présynthétisés. Une fois détachée de son support, la chaîne des désoxyribonucléotides servira de matrice pour synthétiser le brin de DNA complémentaire. Ainsi, des DNA double brins de plus de 50 paires de bases ont pu être synthétisés. La synthèse chimique de DNA à cloner concerne des petits fragments de DNA ('petits gènes')comme ceux des gènes des neuropeptides.
DNA synthétisé à partir de RNA messager (mRNA): un mRNA contenant le polyA ou un mRNA purifié peuvent servir de matrice pour la synthèse de DNA par une transcriptase réverse (DNA polymrase RNA dépendante) de virus. Cette synthèse nécessite une amorce (primer) comme oligo dT. Le DNA obtenu correspond à une partie du gène. Ainsi, des DNA (cDNA) de 2000 paires de bases ont pu être synthétisés à partir de mRNA. mRNA ne contenant pas d'introns (séquences non codantes), le DNA lui correspondant par synthèse ne contient que des gènes avec uniquement leurs exons (séquences codantes).

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Le génie génétique qui conduit aux transformations génétiques s'opérant sur le DNA, s'appuie sur un ensemble d'outils cellulaires et moléculaires dont le clonage.
2.1. VOIE GENE ---> PROTEINE Après isolement d'un gène précis dans une banque de cDNA ou une banque génomique on procède à son séquençage et son analyse. La determination des séquences de nucléotides se fait par les techniques de Maxam et Gilbert ou de Sanger.
Après séquençage, on réalise la synthèse d'un oligopeptide correspondant à une partie de la séquence codante du gène. Cette opération est rendue possible grâce à des appareils pouvant synthétiser des oligopeptides d'environ 30 acides aminés. Pour analyser le produit (gène), on procède à la purification de la protéine par chromatographie d'affinité en utilisant un anticorps monoclonal préparé contre l'oligopeptide préalablement synthétisé ( voir schéma récapitulatif ci dessous). 2.2. VOIE PROTEINE ---> GENE Cette fois, la protéine est purifiée. Néanmoins, son gène reste inconnu. La protéine sera analysée par électrophorèse bidimensionnelle. Seuls qeulques nanogrammes de la protéine peuvent être élués du gel ayant servi de support d'électrophorèse. La protéine isolée peut être séquencée grâce à des appareils automatiques pouvant analyser jusqu'à 10 picomoles de protéines. La séquence obtenue peut être comparée à d'autres séquences des banques de données d'oligopéptides. Les séquences oligonucléotidiques correspondantes seront déterminées. Aussi, le mélange d'oligonucléotides déduit peut être fabriqué à l'aide de machines automatiques. Les différents oligonucléotides sont utilisés comme sondes moléculaires pour rechercher les séquences complémentaires dans une banque de clones de cDNA ou de clones génomiques ( voir schéma récapitulatif ci dessous).	biotechnologies et environnement ------------------------ POSTE INFORMATIQUE LEXIA Recevez les meilleurs offres de Decoclico, tout en gagnant des avantages !!! ----------------- ----------
2.3. OUTILS CELLULAIRES ET MOLECULAIRES DU GENIE GENETIQUE Le génie génétique utilise des outils cellulaires et moléculaire. I/ OUTILS CELLULAIRES. L'isolement et l'amplification d'un gène impose son clonage et sa multiplication dans des cellules de procaryotes (bactéries) ou d'eucaryotes pouvant être mises en culture in vitro. Ces cellules peuvent être réimplantées dans un embryon ou un organisme entier. Aussi, le DNA peut être injecté dans un oeuf qui donnera un nouvel animal une fois réimplanté dans un individu femelle. De façon générale, l'isolement et l'amplification d'un gène se réalisent souvent dans une bactérie. II/ VECTEURS. Le transfert des gènes vers d'autres organismes nécessite un vecteur capable de se transferer dans une cellule cible et de s'autorépliquer. Les vecteurs sont des fragments de DNA contenant une origine de réplication (réplicon). Ils peuvent correspondre à: 1/ Episomes ou Plasmides spécifiques des bactéries. 2/ Episomes ou virus à DNA des cellules eucaryotes. 3/ Virus à RNA pouvant s'intégrer sous l'état de DNA proviral dans le DNA des cellules eucaryotes. 4/ Bactériophages (virus des bactéries) se multipliant dans les bactéries.
III/ ENZYMES DE SYNTHESE ET DE MODIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES. Les enzymes de synthèse de DNA les plus utilisées sont les enzymes de restrictiction (endonucléases) reconnaissant une séquence de 4-6 paires de nucléotides dans le DNA. Ces 'enzymes-ciseaux' peuvent couper le DNA en plusieurs fragments de tailles différentes. Les coupures de DNA génèrent des bouts collants (après coupures 'de travers') ou non (après coupures franches). Des enzymes de synthèse de DNA in vitro sont impliquées dans les grandes opérations du génie génétique. Il s'agit d'abord de la DNA polymerase (DNA pol. I de Kornberg) qui est capable de synthétiser un DNA bicaténaire à partir d'un DNA monocaténaire contenant une amorce ('primer') avec une extrémité 3'OH libre. Une deuxième enzyme; la transcriptase reverse; capable de synthétiser du DNA à partir du RNA (DNA polymérase RNA dépendante) est impliquée dans la fabrication d'un DNA bicaténaire à partir d'un RNA. Le deuxième brin du DNA est synthétisé simultanément avec l'élimination du RNA par la ribonucléase H associée à la même enzyme. Les modification des acides nucléiques utilisées en génie génétique sont de deux types; des modifications internes au DNA et des modifications aux extrémités. Le premier type de modifications consiste à des méthylations par des méthylases concernant une cytosine (C) ou une adénine (A). Le deuxième type de modifications a pour but l'addition ou l'élimination de nucléotides aux deux extrémités du DNA. La désoxynucléotidyl transférase terminale permet la synthèse d'une 'queue' d'oligo X aux deux extrémités 3' du DNA. La kinase et la phosphatase peuvent respectivement fixer ou éliminer un phosphate sur les deux extrémités 5' d'un DNA double brin permettant ainsi aux deux fragments de DNA d'être liés ou séparés. Des ligases permettent de relier les extrémités franches (ligases du bactériophage T4) ou les extrémités à bouts collants (ligase d'E.coli) résultant de l'action des enzymes de restriction sur le DNA. 2.4. TRANSFORMATION DE BACTERIES Les transformations bactériennes peuvent être réalisées par un DNA total bactérien, un plasmide et un bactériophage. La transfection des bactéries par un plasmide, couramment utilisée en génie génétique, permet le transfert des gènes portés par le plasmide (exemple de la résistances à des antibiotiques). La transfection par bactériophage (virus bactérien) consiste en une injection du DNA viral dans la bactérie où il se réplique. Parfois, ce DNA s'intègre dans le DNA bactérien sous forme de prophage. La bactérie porteuse du prophage (bactérie lysogène) peut acquérir un nouveau caractère donné par le bactériophage. 2.5. TRANSFORMATION DES CELLULES EUCARYOTES Les cellules eucarotes maintenues en cultures peuvent être transformées par 4 moyens différents; addition d'un DNA porteur d'un gène, transfection par DNA viral, transformation par fusion cellulaire et transfert de gènes par microinjection de DNA dans un noyau cellulaire.
La transformation de cellules eucaryotes par du DNA consiste à cloner en présence d'un DNA porteur d'un gène précis, des cellules obtenues à partir de tissus permettant d'obtenir des lignées cellulaires en culture in vitro. La transfection de cellules eucaryotes par du DNA viral d'origine animale ou végétale, a pour objectif l'augmentation de l'efficacité du transfert du DNA dans les cellules. Le DNA viral peut s'intégrer dans le DNA cellulaire sous forme de provirus et donne à la cellule de nouveaux caractères, comme l'induction de tumeurs. La transformation de cellules eucaryotes par fusion cellulaire donnant des hybridomes (cellules hybrides), est un autre moyen de transfert de gènes d'une cellule à une autre. Après plusieurs générations, les cellules hybrides peuvent perdre certaines parties du génome (chromosomes,...) et donnent lieu à des phénotypes différents où certains gènes peuvent être localisés sur des chromosomes précis. La transformation de cellules eucaryotes par microinjection de DNA dans le noyau cellulaire permet le transfert de gènes qui s'intègrent de façon stable dans le génome de cellules maintenues en culture. 2.6. CLONAGE D'UN GENE La recombinaison in vitro d'un DNA porteur de gènes qui seront clonés dans des cellules est une des technologies de base du génie génétique. Quatre étapes principales peuvent être distinguées dans la purification d'un gène par génie génétique. Elles concernent les sources du DNA à cloner, l'insertion du DNA dans un vecteur, le clonage du DNA recombiné dans une cellule en culture et l'identification du clone cellulaire ou du virus contenant le DNA recombinant. 2.6.1. SOURCES DU DNA SUJET AU CLONAGE DNA de synthèse chimique: le principe consiste à relier des nucléotides d'enchaînement connu en fixant un trinucléotide sur un support comme le sépharose et en ajoutant d'autres trinucléotides présynthétisés. Une fois détachée de son support, la chaîne des désoxyribonucléotides servira de matrice pour synthétiser le brin de DNA complémentaire. Ainsi, des DNA double brins de plus de 50 paires de bases ont pu être synthétisés. La synthèse chimique de DNA à cloner concerne des petits fragments de DNA ('petits gènes')comme ceux des gènes des neuropeptides. DNA synthétisé à partir de RNA messager (mRNA): un mRNA contenant le polyA ou un mRNA purifié peuvent servir de matrice pour la synthèse de DNA par une transcriptase réverse (DNA polymrase RNA dépendante) de virus. Cette synthèse nécessite une amorce (primer) comme oligo dT. Le DNA obtenu correspond à une partie du gène. Ainsi, des DNA (cDNA) de 2000 paires de bases ont pu être synthétisés à partir de mRNA. mRNA ne contenant pas d'introns (séquences non codantes), le DNA lui correspondant par synthèse ne contient que des gènes avec uniquement leurs exons (séquences codantes).
DNA obtenu à partir du DNA génomique d'une cellule:Le DNA génomique d'une cellule provient d'une digestion par une ou plusieurs enzymes de restriction. Contrairement au cDNA synthétisé à partir du mRNA, le DNA génomique peut contenir des gènes entiers (exons + introns). La coupure du DNA par des enzymes de restriction produit des extrémités se recombinant facilement avec d'autres fragments de DNA comme ceux des DNA vecteurs. Atitre d'exemple, l'enzyme de restriction EcoRI coupe le DNA d'une cellule animale en un million de fragments de longueurs différentes (quelques dizaines à plusieurs milliers de paires de bases). 2.6.2. INSERTION DU DNA SUJET AU CLONAGE DANS UN VECTEUR Le DNA synthétisé chimiquement ou à partir des mRNA ainsi que les fragments de DNA génomique doivent être portés par un vecteur capable de se répliquer et d'être transféré dans une cellule. Pour assurer cette recombinaison in vitro, il est nécessaire d'assurer une préparation préalable du DNA à cloner et du DNA vecteur. La stratégie suivie est leurs coupures par la même enzyme de restriction. Les extrémités collantes des deux DNA se reconnaitront. Elles seront soudées par une ligase. Ainsi, des molécules hybrides (vecteur + DNA à cloner) seront reconstituées. Si cette méthode ne donne pas de résultats satisfaisants, il faudra faire appel à des modifications des extrémités des DNA. Ainsi, des queues oligo dG (20 dG) et d'oligo dC (20 dC) peuvent être ajoutées respecticement au DNA vecteur et au DNA à inserer. Par appariement des deux séquences, le DNA à cloner sera inséré dans le DNA vecteur. Une autre stratégie valable pour le DNA génomique consiste à attacher au DNA à insérer un décamère synthétique (linker) avec digestion par des enzymes de restriction correspondant au site de coupure du DNA vecteur. 2.6.3. CLONAGE DU DNA RECOMBINE DANS UNE CELLULE EN CULTURE Le DNA hybride recombiné et le DNA non recombiné résultant de l'étape du clonage dans un vecteur, seront introduits 1) soit dans des bactéries par transfert (plasmide) ou par infection (bactériophage), 2) soit dans une cellule eucaryote en culture par transfection ou par infection avec un virus à DNA. Le plasmide recombinant transféré dans les bactéries s'autorépliquera facilement. Les colonies bactériennes le contenant peuvent être isolées. Quant au bactériophage recombinant, il se reproduit en lysant les bactéries. On isolera des plages de lyse. Le DNA recombiné peut être cloné dans une cellule en culture. La fusion cellulaire et la précipitation des cellules avec le DNA (par utilisation du phosphate de calcium) permettent la transfection du DNA recombinant. On obtient des cellules transformées. 2.6.4. IDENTIFICATION DU CLONE CELLULAIRE OU DU VIRUS CONTENANT LE DNA RECOMBINANT L'identification du clone cellulaire exige l'utilisation de marqueurs de sélection ou de procédés d'hybridation adaptés. Les marqueurs de sélection sont associés au vecteur ou au fragment de DNA à détecter.Ainsi, la résistance aux antibiotiques liée aux gènes portés par les plasmides bactériens est un marqueur de la présence d'un plasmide recombinant. L'hybridation du DNA recombinant avec un fragment de DNA ou de RNA comlémentaire permet d'identifier le clone désiré dans un mélange hétérogène. Le DNA des clones bactériens est hybridé in situ avec le DNA sonde marqué radioactivement. ALLER A: EXPRESSION DES GENES
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