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Acides nucléiques
 الأحماض النووية
Nucleic acids

Acides nucléiques. Exercice 1 (Réponse 1).
Pour une cellule de Mammifères, le poids moléculaire de l'ADN nucléaire natif est de 9.1011 daltons.

a- Quelle est la longueur en pb et en mètre de cet ADN associé en double hélice (forme B)?

b- La composition en bases de cet ADN montre un rapport A/G=4. Donner le pourcentage de chaque base pour cet ADN.

c- Connaissant la Tm du poly-d-AT (69,3°C) et du poly-d-CG (110°C), quelle sera La Tm de cet ADN, dans les mêmes conditions expérimentales?


Acides nucléiques. Exercice 2 (Réponse 2).

Soient deux ADN, A et B de 6000 pb. L'électrophorèse des deux ADN sur gel d'agarose 0,8% suivie d'une révélation par le bromure d'éthidium, a permis d'obtenir l'éléctrophorégramme 1. Après digestion des ADN par l'enzyme de restriction BamH I, l'électrophorèse donne l'électrophorégramme 2. La figure ci-dessous montre les résultats des électrophorèses. Pour rappel, une enzyme de restriction (endonucléase) coupure spécifiquement l'ADN double brin au niveau d'une séquence bien déterminée.

ADN. Electrophorèse

a- Commenter les profils électrophorétiques A et B des électrophorégrammes 1 et 2.

b- Quels seraient les profils électrophorétiques des deux ADN préalablement soumis à l'action d'une exonucléase avant l'électrophorèse.

c- Donner le profil électrophorétique qui serait obtenu si on fait agir une autre endonucléase de restriction pour laquelle chacune des molécules (A et B) possède deux sites de coupure distants de 4000 pb.


Acides nucléiques. Exercice 3 (Réponse 3).
Classer les molécules d'ADN bicaténaire A, B et C par ordre croissant de leur température de fusion. Il s'agit de molécules constituées de la répétition des séquences suivantes :

ADN A: AAGTTCTCTGAA
ADN B: GGACCTCTCAGG
ADN C: AGTCGTCAATGC


Acides nucléiques. Exercice 4 (Réponse 4).
On considère les ADN L, M et N. L et M ont une taille de 647 pb. L résiste aux exonucléases mais non M. Enfin, N est linéaire, mesure 0,3 µm et a un PM de 291 000 daltons.

a- Donner les caractéristiques des ADN L, M et N relatives à la conformation (linéaire ou circulaire), simple ou double brin, PM, longueur en µm et nombre de nucléotides.

b- On chauffe les ADN L et M et on mesure leur absorbance à 260 nm. On obtient l'enregistrement ci-dessous. Expliquer la différence qui existe entre les deux profils à une température < 50°C. Interpréter les augmentations de la densité optique. Déterminer approximativement la Tm de L et M. Par quoi diffèrent les ADN L et M ?

Acides nucléiques. Absorbance

c- Une solution N1 de l'ADN N a une absorbance de 2,8 à 25°C. En mélangeant 2,5 ml de N1 à 7,5 ml d'eau, on obtient la solution N2. Tracer sur le graphe précédent la courbe correspondant à N2.


Acides nucléiques. Exercice 5 (Réponse 5).
On vise l'amplification génique in vitro d'un fragment d'ADN compris entre les nucléotides 5 et 100 (inclus) de la squence indiquée ci-dessous :

5' GTGCATGAGC ATACATCTTG AAAAAAAAAG ATGAAAAATT TCGACTTTAA
  GCTCGCTGTC TTACCTTTTA AAATCTTCTA CTTCTTGACA GTACTTATCT
  TCTTA 3'      

Trouver les séquences du couple d'amorces, chacune longue de 15 nucléotides.


Acides nucléiques. Exercice 6 (Réponse 6). D'après Eric R. Gauthier, Université Laurentienne, 2007

On procéder à l'analyse d'un ARN. Sa composition globale en bases est 2A, 2C, 1U, 1G.

- Le traitement de l'ARN par la phosphodiestérase de venin de serpent libère pC.

- L'hydrolyse de l'ARN par la ribonucléase pancréatique libère 1C, un dinucléotide qui comprend A et C, et un trinucléotide qui contient A, G et U.
- L'action de la ARNase T2 donne pAp, un dinucléotide qui contient U et C, et un trinucléotide ayant A, G et C.
Quelle est la structure primaire de cet ARN?


Acides nucléiques. Exercice 7 (Réponse 7). D'après Eric R. Gauthier, Université Laurentienne, 2007

On procède à l'analyse d'un ARN dont la composition brute en bases est 2A, 4C, 2G, 1U.
- La ribonucléase pancréatique libère 2Cp, deux dinucléotides dont un contient G et C et l'autre A et U, et un trinucléotide fait de A, C et G.
- Un mélange de ARNase T1 et T2 produit C, Ap, pGp, et deux trinucléotides, le premier contenant A et C et le deuxième CG et U.
- La phosphodiestérase du venin de serpent libère pC.

Quelle est la formule de cet ARN?




Réponses
Acides nucléiques. Exercice 1 (Exercice 1 ).

a-: Longueur de l'ADN = 1,5. 10 9 pb = 0,51 m;
b-:
%C = %G = 10%et %A = %T = 40%.
c-
: Tm = 77,44°C


Acides nucléiques. Réponse 2 (Exercice 2).

a- L'ADN A peut correspondre à un ADN linéaire provenant d'un ADN circulaire (exemple ADN plasmidique) coupé sur les deux brins (suite à une longue conservation. L'ADN B peut correspondre à un ADN circulaire séparé selon ses conformations superenroulée (très mobile) et relachée (coupure sur un seul brin) avec une mobilité relativement faible. Voir électrophorèse de l'ADN des plasmides

ADN de Plasmide. Différentes formes

Avec ces deux molécules séparées selon la forme, on ne peut connaitre le poids exact de l'ADN B. C'est la forme linéaire qui renseigne sur le poids réel de l'ADN.

L'électrophorégramme B montre que les ADN A et B ont un seul site de restriction BamH I donnant deux fragments de 2000 pb et 4000 pb pour l'ADN A, car il est linéaire et un seul fragment de 6000 pb pour l'ADN circulaire B.

b- Si on considère l'action d'une exonucléase sur l' ADN A et l'ADN B, on n'aura aucune bande pour l'ADN A, car il est linéaire. Il sera dégradé sur les extrémités. Par contre le profil de l'ADN B reste inchangé car il est circulaire et non accessible aux exonucléases.

c- ADN A linéaire: 3 fragments, car pour ADN linéaire, n coupures donnent n + 1 fragments

ADN B: circulaire: 2 fragments, car pour ADN circulaire, n coupures donnent n fragments


Acides nucléiques. Réponse 3 (Exercice 3 ).

Tm ADN A < Tm ADN C < Tm ADN B


Acides nucléiques. Réponse 4 (Exercice 4 ).

a: L est circulaire double brin, 388200 daltons, 0,22 micromètres.

M est linéaire, double brin, 388200 daltons, 0,22 micromètres.
N est linéaire, simple brin, 970 nucléotides.

b: (M) = 2. (L), effet hyperchrome, dénaturation thermique, Tm ADN L = 71°C, Tm ADN M = 82°C,
%CG ADN L < %CG ADN M

c: DO 260 nm (N1) = 0,7


Acides nucléiques. Réponse 5 (Exercice 5).

Séquence amorce 1: 5' AGATAAGTACTGTCA 3'
Séquence amorce 2: 5' ATGAGCATACATCTT 3'


Acides nucléiques. Réponse 6 (Exercice 6).

La phosphodiestérase de venin de serpent ne coupe que le nucléotide situé en 3'-terminal de l'ARN, générant un nucléotide 5'-phosphate. Cette information nous indique que Cp est situé en 3'-terminal de notre polynucléotide.
La ribonucléase pancréatique coupe l'ARN du côté 3' des nucléotides pyrimidiques, générant des produits de digestion se terminant par une pyrimidine 3'-phosphate. D'après les résultats obtenus, on peut déduire les séquences suivantes: 5'ACp3', 5'(A,G)Up3'

Finalement, la ribonucléase T2 coupe l'ARN après l'adénosine, générant des fragments se terminant avec une adénosine 3'phosphate. On peut donc utiliser cette information afin d'ordonner les séquences du produit obtenu: 5'(CG)Ap3'

Hydrolyse RNA

La présence de pAp après digestion avec la ribonucléase T2 indique que A est le nucléotide 5'-terminal.
En recoupant les informations obtenues par l'utilisation de ces trois enzymes, on obtient la séquence finale suivante: 5'pACGAUCp3'

Rappel: Les nucléases sont sélectives comme la plupart des enzymes. Elles sont spécifiques des molécules intervenant dans les réactions. Les ADNases (DNases) et les ARNases (RNases) sont spécifiques de l'ADN (DNA) et de l'ARN (RNA), respectivement.


Acides nucléiques. Réponse 7 (Exercice 7).

La phosphodiestérase de venin de serpent libère le nucléotide situé à l'extrémité 3' du fragment.
Le résultat obtenu nous indique que pC est le nucléotide 3' terminal pour notre polynucléotide.
La ribonucléase pancréatique coupe les molécules d'ARN du côté 3' des pyrimidines, générant des fragments se terminant avec une pyrimidine 3' phosphate. Grâce aux fragments obtenus, on peut déduire en partie leur séquence: 5'GCp3', 5'AUp3', 5'(A,G)Cp3'

Le fait que l'on a libéré 2 Cp indique ces nucléotides sont situés tout de suite après U ou C.
L'ARNase T1 coupe du côté 3' de la guanosine, générant des fragments se terminant avec une guanosine 3'phosphate. Quant à la ARNase T2, elle coupe du côté 3' des adénosine, générant des adénosine 3'phosphate. L'utilisation combinée de ces deux enzymes donnera un mélange de fragments coupés par l'un ou l'autre de ces enzymes, ou même par les deux enzymes. On peut déduire la séquence des fragments obtenus: 5'CCAp3', 5'(C,U)Gp3'
On a déduit la présence de deux C dans le premier fragment car on mentionne qu'il s'agit d'un trinucléotide, et qu'il manque un C si l'on fait le décompte des nucléotides obtenus après digestion avec le mélange T1 + T2.

D'après le résultat obtenu avec la ribonucléase pancréatique, l'uridine est précédée de l'adénosine. On aura alors le fragment suivant: 5'AUCGp3'

De plus, toujours d'après le résultat avec T1 + T2, l'obtention de pGp indique que ce dernier est le nucléotide 5'-terminal. Le résultat obtenu avec la ribonucléase pancréatique indique aussi que ce G est suivi de C. Aussi, le fait d'avoir obtenu C et Ap indique que ces deux nucléotides sont situés tout de suite après A ou G.
On a donc jusqu'ici la séquence suivante: 5'pGC....AUCG....C3'
Il ne nous reste que A et C à placer. Comme avec la digestion avec T1 + T2 on a eu la séquence 5'CCAp3', ceci suggère que C est placé entre pGC...AUCG. Enfin, le dernier nucléotide, A, devrait logiquement être situé à l'avant-dernière place.

En tenant compte de ces différents résultats, on arrive à la séquence d'ARN suivante: 5'pGCCAUCGAC3'


Rappel des spécificités des nucléases:
Enzyme ADN, ARN, ADN + ARN a ou b Spécificité
Exonucléases
Phosphodiestérase du venin de serpent ADN + ARN a Débute à l'extrémité 3', produit des XMP-5'
Phosphodiestérase du venin de la rate ADN + ARN b Débute à l'extrémité 5', produit des XMP-3'
Endonucléases
RNase pancréatique ARN b Libère des oligonucléotides à extrémité pyrimidine 3'-phosphate et des nucléosides 3'-phosphate pyrimidiques lorsqu'une pyrimidine est du côté 3' de la liaison diester.
RNase de Bacillus subtilis ARN b Libère des oligonucléotides à extrémité purine 3'-phosphate et des nucléosides 3'-phosphate puriques lorsqu'une purine est du côté 3' de la liaison diester.
RNase T1 ARN b Lorsqu'une guanine est du côté 3' de la liaison diester.
RNase T2 ARN b Lorsqu'une adénine est du côté 3' de la liaison diester.
DNase I pancréatique ADN a Coupe de préférence entre Py et Pu: incise l'ADN bicaténaire avec formation d'extremités 3'-OH
DNase II (Thymus, foie, Staphylococcus aureus) ADN b Produit des oligpnucléotides
Nucléase S1 ADN + ARN a Clive les acides nucléiques monocaténaires et non les acides nucléiques bicaténaires.

Liens utiles: -- Nucléosides, Nucléotides. QCM ------ Acides nucléiques. QCM (Fr, Ar) ------ DNA electrophoresis on agarose gel --- Extraction et séquençage de l'ADN -

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