Enzymes. Composition du site actif

1992 3196 enzymes purifiées (Weeb, 1992 : EC enzyme nomenclature : recommandations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, San Diego, Ca, Academic Press.

1.2. STRUCTURE FONCTIONNELLE DES ENZYMES

QCM interactif 1..

1.2.1. Site actif

LA CATALYSE ENZYMATIQUE PASSE PAR LA FORMATION D'UN SITE ACTIF. Le site actif des enwymes est une région privilégiée de l'enzyme qui interagit avec les substrats (essentiellement)

qui seront eux même transformés en produits. Le site actif est constitué d'acides aminés (AA) de 4 types: 1/ AA 'de contact', 2/ AA 'auxiliaires', 3/ AA 'collaborateurs' et 4/ AA 'non collaborateurs'. Ce sont les groupements fonctionnelles des radicaux (R) des AA qui interviennent dans la catalyse. Ces groupements sont peu nombreux. Il s'agit le plus souvent des résidus SERYL, ASPARTYL ou GLUTAMYL, CYSTEYL, HISTIDYL LYSYL et accessoirement ARGINYL et TYROSYL. La capacité des AA correspondant à participer à la catalyse est liée à leur aptitude à transférer des électrons (caractère d'agents nucléophiles) et des protons (caractère acide-base selon Broensted). Le caractère de nucléophilie est plus prononcé pour la sérine, la cystéine et l'acide aspartique. Le caractère acide-base est plus prononcé pour l'histidine et la tyrosine. L'histdine intervient comme relais de proton où le noyau imidazole joue le rôle de 'renforceur' du caractère de nucléophilie des donneurs d'électrons (substrats) en captant le proton de leur OH.
Ce sont finalement que quelques acides aminés de l'enzyme (AA de contact) qui sont nécessaires pour la catalyse. L'élimination de certains acides aminés n'entraîne pas la disparition de l'activité enzymatique.

1.2.2. Structures fonctionnelles des enzymes (s.tertiairem s.quaternaire)

La structure tertiaire (ou tridimensionnelle ou conformation) correspondant au repliement de la protéine enzymatique est une structure primordiale nécessaire dans la catalyse. Elle permet la formation du site actif par rapprochement des acides aminés le constituant (ex AA 57, AA195, AA220). Cette conformation joue, également un rôle dans la protection du site actif. Monod avait proposé que le site actif présente une conformation adaptée au substrat avant même que celui ci ne soit fixé (système clé-sérrure). Or, la diffraction aux rayons X a montré que l'organisation tridimensionnelle du site actif n'est pas tout à fait la même suivant l'absence ou la présence du substrat. Ainsi, était née la théorie dite de 'Conformation induite' (induced fit) où le site actif est perçu comme un 'ensemble souple' en s'adaptant exactement à la conformation du substrat.L'une des preuves expérimentales appuyant cette théorie réside dans les changements de spectres d'absorption et de fluorescence de certaines enzymes en présence ou en absence des substrats. C'est le cas, par exemple, de la phosphoglucomutase (PGM) qui change de fluorescence en présence de son substrat (le Glucose 6-Phosphate) (fluorescence due aux résidus Tryptophanyl et Tyrosyl).

La structure quaternaire correspond à l'association de l'enzyme en sous unités. Elle donne les derniers ajustements conformationnels. Cette structure conduit à la notion d'isoenzymes (isozymes) qui sont des formes de la même enzyme catalysant la même réaction, mais dont certaines propriétés physico-chimiques (charge électrique, taille,…) sont différentes. Les isoenzymes sont en général mises en évidence par la technique d'électrophorèse. La lactate déshydrogénase (LDH) est l'un des exemples les mieux connus.

Les isoenzymes sont exploitées dans le domaine d'étiquetage des ressources génétiques animales, végétales et microbiennes. Elles sont utilisées en génétique des populations vu leur caractère de codominance (les hybrides sont facilement différenciés par rapport aux parents).

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TAKWEEN. ENZYMOLOGIE
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Les enzymes, catalyseurs biologiques, sont essentielles pour la vie. Connaître comment elles assurent la catalyse renvoie à l'élucidation de leurs mécanismes, sans oublier que cela se passe par le contact du substrat avec l'enzyme à travers quelques acides aminés qui constituent le 'site actif'. Dans le cas de plusieurs substrats, le suivi de la catalyse homogène permet d'élucider en détail le comportement de l'enzyme et déterminer les paramètres cinétiques correspondants.
1.1. ENZYMES. GENERALITES Les enzymes sont des catalyseurs biologiques qui accélèrent les réactions métaboliques d'un organisme vivant. Elles résultent, au moins en ce qui concerne leur partie protéique, d'une synthèse des protéines au niveau cellulaire. Il y'a au moins une enzyme différente par réaction catalysée, ce qui représente des milliers d'enzymes par organisme. Les enzymes sont réparties sur des organites cellulaires différents et peuvent, ainsi, être qualifiées de "enzymes marqueurs". Selon leur localisation in vivo, les enzymes peuvent être groupées en : * Enzymes extracellulaires (ou exoenzymes) : elles sont synthétisées à l'intérieur de la cellule, puis sécrétées dans l'espace extracellulaire. * Enzymes intracellulaires : elles sont synthétisées et utilisées entièrement à l'intérieur de la cellule où elles sont généralement liées à des particules subcellulaires ou membranes intracellulaires rendant leur extraction plus difficile.		www.biotech-ecolo.net ------------------- www.maxicook.com Top Office, mille et une façons de vivre votre bureau
L'extraction et la purification des enzymes restent liées aux techniques de séparation utilisées. Ainsi, dans une dizaine d'années environ et grâce à la chromatographie d'affinité, le nombre d'enzymes isolées est passé de 1300 en 1968 à plus de 3000 enzymes en 1992 et continu d'augmenter (voir Tableau évolutif). IMPACT DES AVANCEES TECHNIQUES EN MATIERE DE METHODOLOGIES DE PURIFICATION SUR LE NOMBRE D'ENZYMES PURIFIEES. 1833 (Payen & Persoz): Précipitation par l'alcool. Première préparation enzymatique (extrait acqueux d'orge germé). 1923 (Svedberg & Nichols) Première ultracentrifugation analytique 1926 (Sumner) Cristallisation de l'uréase et établissement de la nature protéique des enzymes.
1930 Environ 80 enzymes sont isolées 1935 (Adams & Holms) Introduction des résines échangeuses d'ions dans les procédés de purification. 1938-1941 (Zechmeister & Brockman) Utilisation de la chromatographie d'adsorption. 1947 Début des techniques de filtration sur gel de Sephadex et électrophorèse. Plus de 200 enzymes isolées. 1968 Filtration sur gel de Sephadex et électrophorèse. Plus de 1300 enzymes isolées. 1980 Chromatographie d'affinité. Plus de 2000 enzymes purifiées. 1992 3196 enzymes purifiées (Weeb, 1992 : EC enzyme nomenclature : recommandations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, San Diego, Ca, Academic Press. 1.2. STRUCTURE FONCTIONNELLE DES ENZYMES QCM interactif 1.. 1.2.1. Site actif LA CATALYSE ENZYMATIQUE PASSE PAR LA FORMATION D'UN SITE ACTIF. Le site actif des enwymes est une région privilégiée de l'enzyme qui interagit avec les substrats (essentiellement) qui seront eux même transformés en produits. Le site actif est constitué d'acides aminés (AA) de 4 types: 1/ AA 'de contact', 2/ AA 'auxiliaires', 3/ AA 'collaborateurs' et 4/ AA 'non collaborateurs'. Ce sont les groupements fonctionnelles des radicaux (R) des AA qui interviennent dans la catalyse. Ces groupements sont peu nombreux. Il s'agit le plus souvent des résidus SERYL, ASPARTYL ou GLUTAMYL, CYSTEYL, HISTIDYL LYSYL et accessoirement ARGINYL et TYROSYL. La capacité des AA correspondant à participer à la catalyse est liée à leur aptitude à transférer des électrons (caractère d'agents nucléophiles) et des protons (caractère acide-base selon Broensted). Le caractère de nucléophilie est plus prononcé pour la sérine, la cystéine et l'acide aspartique. Le caractère acide-base est plus prononcé pour l'histidine et la tyrosine. L'histdine intervient comme relais de proton où le noyau imidazole joue le rôle de 'renforceur' du caractère de nucléophilie des donneurs d'électrons (substrats) en captant le proton de leur OH. Ce sont finalement que quelques acides aminés de l'enzyme (AA de contact) qui sont nécessaires pour la catalyse. L'élimination de certains acides aminés n'entraîne pas la disparition de l'activité enzymatique. 1.2.2. Structures fonctionnelles des enzymes (s.tertiairem s.quaternaire) La structure tertiaire (ou tridimensionnelle ou conformation) correspondant au repliement de la protéine enzymatique est une structure primordiale nécessaire dans la catalyse. Elle permet la formation du site actif par rapprochement des acides aminés le constituant (ex AA 57, AA195, AA220). Cette conformation joue, également un rôle dans la protection du site actif. Monod avait proposé que le site actif présente une conformation adaptée au substrat avant même que celui ci ne soit fixé (système clé-sérrure). Or, la diffraction aux rayons X a montré que l'organisation tridimensionnelle du site actif n'est pas tout à fait la même suivant l'absence ou la présence du substrat. Ainsi, était née la théorie dite de 'Conformation induite' (induced fit) où le site actif est perçu comme un 'ensemble souple' en s'adaptant exactement à la conformation du substrat.L'une des preuves expérimentales appuyant cette théorie réside dans les changements de spectres d'absorption et de fluorescence de certaines enzymes en présence ou en absence des substrats. C'est le cas, par exemple, de la phosphoglucomutase (PGM) qui change de fluorescence en présence de son substrat (le Glucose 6-Phosphate) (fluorescence due aux résidus Tryptophanyl et Tyrosyl). La structure quaternaire correspond à l'association de l'enzyme en sous unités. Elle donne les derniers ajustements conformationnels. Cette structure conduit à la notion d'isoenzymes (isozymes) qui sont des formes de la même enzyme catalysant la même réaction, mais dont certaines propriétés physico-chimiques (charge électrique, taille,…) sont différentes. Les isoenzymes sont en général mises en évidence par la technique d'électrophorèse. La lactate déshydrogénase (LDH) est l'un des exemples les mieux connus. Les isoenzymes sont exploitées dans le domaine d'étiquetage des ressources génétiques animales, végétales et microbiennes. Elles sont utilisées en génétique des populations vu leur caractère de codominance (les hybrides sont facilement différenciés par rapport aux parents). Retour à: ENZYMES. CATALYSEURS BIOLOGIQUES
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