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Carboxylestérase et Phénylalanine ammonia lyase (PAL)

La carboxylestérase (estérase) est inhibée par les produits 1-naphtol et acide acétique. La phénylalanine ammonia lyase (PAL) est inhibée par l'ammonium.


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Carboxylestérase et Phénylalanine ammonia lyase (PAL) . Inhibiteurs des activités enzymatiques (Examen S5)


Examen de rattrapage de l'élément de module 'Relation sructure-fonction dans le métabolisme primaire et éléments de base du métabolisme secondaire des plantes', module 'Biochimie, Génétique et Amélioration des Plantes' du Parcours S5 : 'Biologie Appliquée aux Productions Végétales', Février 2013, Durée : 30 minutes .......... Corrections brèves
QUESTION 1
Le latex de Synadenium grantii, plante de la famille des Euphorbiaceae, est connu par son caractère toxique. Il contient une activité esterolytique, due à la présence de certaines enzymes comme la carboxylestérase et la cholinestérase. A partir du latex dilué, Govindappa et al. (1987, J. Biosci. 12, 71-86) ont purifié la carboxylestérase et en ont étudié la cinétique et les modes d'inhibition exercés par l'acide acétique et le 1-naphtol vis-à-vis du 1-naphtyl acétate, substrat de la réaction.

Synadenium grantii

Les résultats relatifs à cette étude sont montrés dans la figure suivante où les représentations de Lineweaver-Burk sont utilisées pour interpréter les données cinétiques.

Estérase. Inhibition

1) A l'aide des deux représentations de Lineweaver-Burk, déterminer les valeurs approximatives des paramètres cinétiques (Km et Vmax) de la carboxylestérase du latex de Synadenium grantii pour le 1-naphthyl acétate comme substrat.
2) Quels types d'inhibition exercent l'acide acétique et le 1-naphthol vis-à-vis du 1-naphthyl acétate ? Justifier votre réponse.
3) Pour chaque inhibiteur, schématiser toutes les combinaisons possibles entre l'enzyme, le substrat et l'inhibiteur.
4) Quels effets ont les inhibiteurs sur les paramètres cinétiques de l'enzyme trouvés avec le 1-naphthyl acétate, comme substrat.
5) Donner un protocole expérimental permettant de révéler par électrophorèse les différentes formes de la carboxylestérase du latex de Synadenium grantii.

QUESTION 2.

L'effet inhibiteur de l'ammonium sur la phénylalanine ammonia lyase (PAL) extraite à partir des fruits du Chérimolier, Annona cherimola (Maldonado et al. (2007, J. Food Chem. 31, 161-178), a été testé en présence de différentes concentrations de phénylalanine (Phe) comme substrat. L'activité de la PAL est évaluée en mesurant la densité optique à 290 nm, longueur d'onde où l'acide cinnamique (produit libéré) présente une absorption maximale. La vitesse initiale de la réaction (V) est exprimée en nmoles d'acide cinnamique par heure et par mg de protéines. Le résultat relatif à l'effet des concentrations 1 mM et 3 mM d'ammonium sur l'activité de la PAL est représenté ci-dessous sous forme de représentation de Linweaver-Burk.

1) Sur quelles formes d'enzyme (complexée ou/et libre) se fixe l'ammonium. Donner un schéma de complexation. Justifier votre réponse.
2) Déterminer les valeurs approximatives des paramètres cinétiques (Km et Vmax) de la PAL des fruits du Chérimolier pour la phénylalanine comme substrat.


Corrections brèves


Question 1:
1) Valeurs approximatives des paramètres cinétiques (Km et Vmax) de la carboxylestérase du latex pour le 1-naphthyl acétate comme substrat:
Le point d'intersection de la droite représentant 0 mM acide acétique et 0 mM 1-naphthol avec l'axe des abscisses (1/(S)) donne -1/Km qui est égal à environ - 0,12x 10000 M puissance -1 en substrat 1-naphthyl acétate. Donc Km = 0,83 mM. Le point d'intersection de la droite représentant 0 mM acide acétique et 0 mM 1-naphthol avec l'axe des ordonnées donne 1/Vmax. Il est égal à environ 2,5 (1/unité de vitesse). Soit Vmax = 0,4
2)Types d'inhibition exercés par l'acide acétique et le 1-naphthol vis-à-vis du 1-naphthyl acétate ? Justifier votre réponse:
- L'acide acétique est inhibiteur compétitif vis à vis du 1-naphthyl acétate (Vmax reste inchangée, Km augmente)
- Le 1-naphthol est non compétitif vis à vis du 1-naphthyl acétate (Vmax diminue, Km inchangée)
3)Combinaisons possibles entre l'enzyme, le substrat et les 'inhibiteurs:
acide acétique (I): inhibiteur compétitif/S
- 1-naphthol (I): inhibiteur non compétitif/S
4)Effets des inhibiteurs sur les paramètres cinétiques de l'enzyme trouvés avec le 1-naphthyl acétate, comme substrat: acide acétique (I): inhibiteur compétitif/S -- 1-naphthol (I): inhibiteur non compétitif/S
5)Protocole expérimental permettant de révéler par électrophorèse les différentes formes de la carboxylestérase du latex de Synadenium grantii: Après électrophorèse non dénaturante sur gel on met en évidence la présence de l'enzyme par addition d'une solution du substrat 1-naphthyl acétate. Après incubation, le 1-naphthol libéré (produit de la réaction) peut réagit avec un azodye (colorant) qu'on ajoute sur le gel pour obtenir un précipité coloré visible à l'oeil nu.
Question 2:
1) Formes d'enzyme (complexée ou/et libre) sur lesquelles se fixe l'ammonium et schéma de complexation. Justifier votre réponse: L'ammonium se fixe, avec des affinités différentes, sur les formes d'enzyme libre et enzyme complexée avec le substrat. Pour la PAL, l'ammonium est un inhibiteur mixte vis à vis de la phénylalanine.
2)Valeurs approximatives des paramètres cinétiques (Km et Vmax) de la PAL des fruits du Chérimolier pour la phénylalanine comme substrat:
Le point d'intersection de la droite représentant 0 mM d'ammonium avec l'axe des abscisses (1/(S)) donne -1/Km qui est égal à environ - 22,5 mM puissance -1 en substrat Phe. Donc Km = 0,04 mM. Le point d'intersection de la droite représentant 0 mM d'ammonium avec l'axe des ordonnées donne 1/Vmax. Il est égal à environ 0,02 nmol-1 x h x mg. Soit Vmax = 50 nmol/h/mg


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