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Catalyse enzymatique . Exercices - التحفيز الأنزيمي

La cayalyse enzymatique (التحفيز الأنزيمي) exige des conditions optimales comme le pH et les concentrations en substrats. La cinétique varie entre enzymes michaeliennes et enzymes allostériques. L'effet des inhibiteurs réversibles est variable d'un inhibiteur à l'autre.


Liens utiles: Enzymologie-enzymes. Exercices -- Enzymes, métabolisme. Exercices --- Enzymes, Km et Vmax. Exercices --
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Enzymes, inhibiteurs

أنزيمات،  مثبطات

Enzymes, Inhibitors
Catalyse enzymatique
التحفيز الأنزيمي
Enzyme catalysis

Catalyse enzymatique. Question 1 -- Réponse 1

L'effet du pH sur l'activité d'une enzyme est démontré dans le graphique ci-contre:

Comment explique-t-on l'effet du pH sur l'activité de l'enzyme?

Enzymes. Effet pH

Le pH optimal varie beaucoup d'une enzyme à l'autre. Quelles chaînes latérales retrouverait-on au site actif d'enzymes dont le pH optimal est de: a) pH 4, b) pH 11

Catalyse enzymatique. Question 2 -- Réponse 2

On étudie la cinétique de deux enzymes (A et B). A partir des données suivantes, determiner le type d'enzyme (enzyme michaelienne ou allosterique) et expliquez l'allure des courbes représentant la vitesse (v) en fonction de la concentration du substrat (S).

[S] (x 103 M)

v (enzyme A) (µmol/min)

v (enzyme B) (µmol/min)
0,00 0,00 0,00
0,50 8,80 0,30
1,00 14,00 1,00
2,00 19,00 4,70
3,00 21,50 12,40
4,00 22,80 19,00
5,00 22,30 21,80
6,00 23,50 22,80
8,00 23,60 23,30

Catalyse enzymatique. béta-galactosidase -- Réponse brève

Correction détaillée dans le livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes' avec DVD, Baaziz, 2013, pages 139-144

Indicateur

A pH 7,7 et 25°C, les cinétiquesq d'hydrolyse de l'o-nitrophényl-galactoside par la béta-galactosidase de la bactérie Escherichia coli ont été étudiés en absence ou en présence de l'un des inhibiteurs suivants: o-nitrophényl-béta-D-thiogalactoside (ONPTG), maltose et mélibiose. Les mesures de vitesses initiales (v) pour chacune de ces expériences sont données dans le tableau suivant comme la variation de l'absorbance à 410 nm par minute.

Séparation

Enzymes, Proteines


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(S) en M v en absence d'inhibiteur v en présence de ONPTG 3x10-4 M v0 en présence de maltose 0,26 M v en présence de mélibiose 0,17M
2,5 x 10-5 0,033 0,018 0,0165 0,027
5,0 x 10-5 0,055 0,023 0,0275 0,041
10,0 x 10-5 0,0825 0,055 0,041 0,055
25,0 x 10-5 0,118 0,091 0,059 0,069
50,0 x 10-5 0,138 0,118 0,059 0,075
100,0x 10-5 0,150 0,138 0,075 0,079

1/ A partir des représentations graphiques de Lineweaver-Burk (1/v = f(1/(S)), tracées en absence ou en présence de l'inhibiteur (I), préciser les types d'inhibition exercés exercées par les trois inhibiteurs vis à vis du substrat (S = ONPG). Calculer les constantes cinétiques Vmax (en absence d'inhibiteur), Vmax' (en présence d'inhibiteur), Km (en absence d'inhibiteur) et et Km' (en présence d'inhibiteur). Discuter l'effet de chaque inhibiteur sur l'activité enzymatique et la liaison entre l'enzyme (E), le substrat (S) et l'inhibiteur (I).

1)  من خلال رسم منحنيات Linweaver-Burk (1/v = f(1/(S))، بغياب المثبطات (I) و بحضورها، حدد نوعية المثبطات الثلاثة لأنزيم بيتا كلكتوزيداز عند بكتيريا E-coli مع احتساب الثوابت الحركية مثل السرعة القصوى  بغياب المثبط  (Vmax) و بحضوره (Vmax’) و ثابت ميكايلس بغياب المثبط  (Km) و بحضوره (Km). ناقش وقع كل مثبط على نشاط أنزيم بيتا كلكتوزياز و العلاقة الترابطية بين الأنزيم (E) و مادة الأساس (S) و المثبط (I).

2/ Calculer les constantes d'inhibition pour chaque inhibiteur (Ki et Ki') et comparer l'affinité de l'enzyme pour chaque inhibiteur.

2)  احتسب ثابت أو ثوابت الإعاقة لكل مثبط (Ki و Ki) و قارن ألفة الأنزيم لكل مثبط.

Liens utiles:

- Glucokinase, Hexokinase, béta-galactosidase et phospholipase A2. Examen (pdf)


Réponses brèves

Catalyse enzymatique. Réponse à la question 1 -- Question 1

1/ Le fait que le pH optimal de l'enzyme soit à pH 8,0 suggère que l'état d'ionisation (ou de protonation) de résidus d'acide aminé du centre actif de l'enzyme est important pour l'activité de cette dernière. Par exemple, à pH inférieur à 8, la protonation de la chaîne latérale d'un résidu histidine (pKaR = 6) pourrait altérer le mécanisme de catalyse enzymatique soit directement au sein du site actif, soit indirectement en induisant un changement conformationnel de la protéine.
À un pH supérieur à 8, la déprotonation de groupements précis (e.g chaîne latérale de Tyr ou Lys; groupe amino-terminal) pourrait avoir la même conséquence sur l'activité enzymatique.

2/ a) Pour une enzyme dont le pH optimal est de 4, on peut supposer que la partie ascendante de la courbe pourrait être attribuable a l'ionisation du groupe carboxyl de la chaine laterale d'un Asp, ou du groupe alpha-carboxyl de l'acide amine C-terminal. Pour la partie descendante, elle pourrait être le resultat de la deprotonation de l'His ou de l'ionisation de la Glu.
b) Pour une enzyme dont le pH optimal est de 11, la portion ascendante de la courbe pourrait être attribuable à la déprotonation du groupe amino de la chaine laterale de Lys. Quant a la partie descendante de la courbe, elle pourrait être la conséquence de la deprotonation de Arg.

Catalyse enzymatique. Réponse à la question 2 -- Question 2

On doit d'abord tracer le graphe de la vitesse de la réaction en fonction de la concentration en substrat (voir ci dessous).

D'après l'allure du graphe, A est une enzyme ordinaire michaelienne qui suit la cinétique de Michaelis-Menten. La vitesse initiale de la réaction catalysée par l'enzyme A ne dépend que de la concentration du substrat. La vitesse maximale étant atteinte en présence d'un excès de substrat.
Quant à l'enzyme B, on peut conclure qu'elle est une enzyme allostérique. En effet, à des concentrations peu élevées de substrat, l'enzyme (qui possède plusieurs sites de liaison du substrat) adopte une conformation telle que son affinité pour le substrat est faible. La vitesse de réaction est alors lente. Par contre, la liaison d'une molécule de substrat à l'enzyme induit un changement conformationnel chez cette protéine qui a pour conséquence d'augmenter l'affinité des autres sites envers le substrat. Plus la concentration en substrat augmente, plus le nombre de sites à haute affinité pour le substrat augmente. Ceci conduit à une vitesse élevée de la réaction catalysée par l'enzyme B.

Catalyse enzymatique. Réponse à la question 3 -- Question 3

galactosidase. Inhibiteurs

- A partir de la courbe 1, l'ONPTG est inhibiteur compétitif vis à vis de l'ONPG. Il ne peut former que des complexe binaires avec l'enzyme (absence de complexe ternaires --> voir page 84 du livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes', 2013).

- A partir de la courbe 2, le maltose est inhibiteur non compétitif vis àvis de l'ONPG. Avec l'enzyme et le substrat, Il forme un complexe ternaire non productif. La Vmax est affectée --> voir page 95 du livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes', 2013).

- A partir de la courbe 3, le mélibiose est inhibiteur incompétitif vis à vis de l'ONPG). Il ne peut se fixer que sur l'enzyme préalablement complexée avec le substrat. Il est dit 'inhibiteur conditionnel (sa fixation sur l'enzyme est conditionnée par la fixation du substrat d'abord) -> voir page 89 du livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes', 2013).

inhibiteurs compétitif, incompétitif, mixte

2/ ONPTG: Ki = 3 x 10-4M
Maltose: Ki = 0,26 M (= Ki')
Mélibiose: Ki' = 0,17 M

voir page 144 du livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes', 2013).



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