Les enzymes, catalyseurs biologiques, sont essentielles pour la vie. Connaître comment elles assurent la catalyse renvoie à l'élucidation de leurs mécanismes, sans oublier que cela se passe par le contact du substrat avec l'enzyme à travers quelques acides aminés qui constituent le 'site actif'. Dans le cas de plusieurs substrats, le suivi de la catalyse homogène permet d'élucider en détail le comportement de l'enzyme et déterminer les paramètres cinétiques correspondants.

. QCM-Enzymes. Structure et fonction (bases)
- QCM-Inhibiteurs-1
- QCM-Inhibiteurs-2.
- Exercice-1 ---
- Examen-1 --- Examen-2 --- Examen-3

1.3. INTERACTIONS MOLECULAIRES ENZYME (E)-SUBSTRAT (S)

QCM interactif 1..

1.3.1. Formation de complexe enzyme-substrat (ES)
LA CATALYSE ENZYMATIQUE. COMMENT S'EFFECTUE-T-ELLE ? La catalyse enzymatique d'une réaction biochimique s'effectue par formation de complexe Ensyme-Substrat (complexe E-S).

Des produits de la réaction résultent de la formation du complexe E-S. La vitesse d'apparition des produits (V) fait l'objet de la cinétique enzymatique. Celle ci peut être 'hyperbolique' (ou Michaellienne, MICHAELLIS, 1902) ou sigmoïde (ou allostérique) lorsqu'elle est étudiée en fonction de la concentration en substat (S).

Bien sûre. On peut le faire par plusieurs procédures dont l'utilisation d'inhibiteurs qui peuvent être ou non des analogues structuraux des vrais substrats de l'enzyme. Selon les types de complexes qu'ils forment en présence de l'enzyme et/ou du substrat et la modification de la cinétique qu'ils entraînent, les inhibiteurs sont qualifiés de 'compétitiffs', 'incompétitifs', 'non compétitifs' ou 'mixtes'.

EXEMPLES D'APPLICATION DES INHIBITEURS.
1/ Les sulfamides (antibiotiques): analogues structuraux de l'acide p-aminobenzoïque, substrat d'enzymes bactériennes synthétisant l'acide folique, coenzyme nécessaire pour la croissance bactérienne.
2/ Les médicaments du traitement du SIDA.

1.3.2. Cinétique enzymatique et Equation de Michaelis-Menten

Une réaction catalysée par une enzyme comprend au moins trois réactions simples pouvant être représentées par l'enchaînemenr réactionnel suivant:

Fixation du substrat (S) sur l'enzyme (E), formation du complexe (ES), Transformation du substrat fixé (ES) en produit (EP), Dissociation du complexe (EP) et Libération du produit (P).

La vitesse de réaction est difficile à mesurer en présence de S et P, surtout à l'équilibre!
On mesure de préférence la 'vitesse initiale':
Au début de réaction, P n'est pas encore formé, et on présume que le complexe EP se dissocie plus vite qu'il ne se forme à partir de ES, c'est-à-dire que k3 > k2, k-2 . La réaction k2 est limitante de la formation de P. Dans ces conditions, le schéma se simplifie:

Leonor Michaelis et Maud Menten (1912) ont déduit de ce modèle une équation qui prédit la vitesse initiale (de formation de P) en fonction de la concentration du substrat:
Vitesse initiale de la réaction: vi = d[P]/dt = k2·(ES)
La vitesse de réaction dépend de la concentration du complexe enzyme-substrat ES dont il faut l'évaluer:
ES se forme à partir de E + S et se décompose soit en E + S , soit en E + P .
Vitesse de formation de ES: vf = k1·(E)·(S)
Vitesse de dissociation de ES: vd = (k-1+ k2)·(ES)
(ES) atteint rapidement une valeur constante (condition dite de "steady state"),
donc: vf = vd
k1·(E)·(S) = (k-1+ k2)·(ES)
(ES) = (E)·(S).k1/ (k-1+ k2), soit Km = (k-1+ k2) /k1 appellée constante de Michaelis -Menten,
(ES) = (E)·(S) / Km (equation 1)
La vitesse initiale vi = k2.(ES), la vitesse maximale est obtenue lorsque toute l'enzyme est complexée sous forme 'enzyme totale' (ET). Donc: (ES) = (ET) et Vmax = k2.(ET)
Faisons le rapport vi/Vmax: vi/Vmax = (ES)/(ET) avec (ET) = (E) + (ES)
vi/Vmax = (ES)/[(E)+(ES)] (equation 2)
En remplaçant (E) par sa valeur déduite de l'équation 1 ((E) = (ES).Km/(S)), on trouve:
vi/Vmax = (ES)/[(ES).Km/(S) + (ES)] = 1/[1 + Km/(S)], soit vi = Vmax.1/[1 + Km/(S)] qui peut être écrite:

vi = Vmax. (S)/[(S) + Km]

1.3.3. Equation de Michaelis-Menten. Cas spéciaux et représentation graphique

Cas spéciaux ou extrêmes: (S)>> Km, vi = Vmax·(S)/(S), vi = Vmax; vi indépendente de (S), saturation, asymptote 1

(S)<< Km, vi = Vmax·(S)/Km, dépendence linéaire de (S), substrat limitant, asymptote 2.

(S)= Km, vi = Vmax· Km / 2 Km, vi = Vmax / 2, demi-saturation de l'enzyme.

Vmax est la vitesse maximale que peut atteindre la réaction lorsque l'enzyme est saturée de substrat,
c'est-à-dire lorsque (ET) = (ES).
Km est la concentration de substrat qui sature l'enzyme à moitié. C'est une mesure de l'affinité de l'enzyme pour le substrat: plus l'affinité est élevée, plus Km est petit.
k2 (= Vmax/(ET)) est souvent appelée constante catalytique kcat.
Le rapport kcat/Km est souvent donné comme mesure de l'efficacité catalytique, car il correspond à une constante de vitesse pour de basses concentrations de substrat (S) << Km, donc (E) = (ET)
vi= Vmax· (S)/ Km = kcat·(E)·(S)/ Km = (E)· (S)· kcat/Km

Linéarisation de l'équation de Michaelis-Menten
Une hyperbole est difficile à tracer manuellement. Des erreurs sur l'estimation de la Vmax sont possibles.Pour simplifier la représentation graphique de l'équation de Michaelis-Menten, on transforme l'hyperbole en droite. L'exemple en est la transformation de Lineweaver et Burke:
1 / vi = 1 / Vmax + (Km / Vmax )· 1 / (S). Cette équation représente une droite de pente Km / Vmax
L'intersection sur l'axe vertical est 1 / Vmax et sur l'axe horizontal 1 / Km .

1.3.4. Expressions de l'activité enzymatique
Unité officielle: katal (kat), quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde. Le katal n'est jamais utilisé, car beaucoup trop grand. On doit utiliser des sous-unités comme les µkat (10-6 katal), nkat (10-9 katal) ou pkat (10-12 katal).
L' "unité internationale" (IU, International Unit), utilisée par la plupart des biochimistes. Elle correspond à la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 µmole de substrat par minute. 60 IU valent donc 1 µkat.
Le nombre de rotations ( kcat ) est le nombre de molécules de substrat transformées par molécule d'enzyme par seconde (ou le nombre de moles de substrat transformé par mole d'enzyme.
L'activité molaire est le nombre de moles de substrat transformé par mole d'enzyme par minute (kcat x 60).
Sans connaître le poids moléculaire de l'enzyme, on peut quand même mesurer l'activité spécifique , soit l'activité par mg de protéine purifiée. Normalement, elle est donnée en IU/mg protéine (ou µkat/mg).
Si on calcule l'activité spécifique sur un extrait non-purifié (soit un mélange de protéines), elle indique la pureté d'une enzyme.
Au cours d'une purification d'enzyme, on mesure régulièrement:
l'activité totale (IU ou µkat), la quantité totale de protéines (mg) et le volume total de solution (ml).
De ces trois valeurs, on peut calculer:
l'activité spécifique (activité totale / quantité totale de protéine, IU/mg), le rendement (activité totale / activité totale avant la première étape de purification) et le taux de purification (activité spécifique / activité spécifique avant la première étape de purification).
L'activité spécifique et le taux de purification atteigne une valeur maximale lorsque l'enzyme est pure.

1.3.5. Inhibition par excès de substrat

Dans de plusieurs enzymes, le substrat peut former des complexes du type ESS, non réactifs du fait que le substrat est incorrectement disposé dans le site actif. L'inhibition par excès de substrat est analogue à celle exercée par un inhibiteur (I) conditionnel (inhibiteur incompétitif), en remplaçant I par le substrat (S). Le complexe ESS n'est pas productif (figure ci dessous). KS et Vmax diminueront d'un facteur (1 + (S)/KI). Ils seront tous divisés par le même facteur et l'équation de vitesse deviendra comme ci dessous:

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