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Enzymologie (exercices S4). Cas d'enzymes variées
أنزيمولوجيا. تمارين

L'enzymologie (أنزيمولوجيا) du niveau S4 concerne des cas d'enzymes variées avec différentes cinétiques en présence des substrats et en absence ou en présences des inhibiteurs (compétitifs, non compétitifs, incompétitifs et mixte).


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enzymes. Enzymologie

انزيمات، أنزيمولوجيا
Enzymes, Enzymology

Sur cette même page: Enzymologie de la thréonine hydrolyase -- Enzymologie de la carboxypeptidase -- Enzymologie de la créatine kinase --


Enzymologie de la thréonine hydrolyase (adapté à partir de Lafont et al. Exercices de Biochimie)
On étudie la cinétique de l'enzyme thréonine déshydratase ou L-thréonine hydro-lyase (E.C.4.2.1.16) d'E. Coli. Cette enzyme catalysant la transformation de la L-thréonine (4 carbones) en acide 2-oxobutyrique (4 carbones) + ammonic (désamination), est la première enzyme spécifique de la biosynthèse de l'isoleucine.
Concentration en substrat (M) Vitesse initiale (mole/min/ml d'enzyme)
0,00100 0,000125
0,00125 0,000150
0,00167 0,000177
0,00250 0,000228
0,00500 0,000315

L'action de deux inhibiteurs sur l'enzyme a été étudiée. Elle concerne D-allothréonine (isomère de L-thréonine) et L-isoleucine (produit final de la voie métabolique). Les vitesses initiales de l'enzyme obtenues avec L-thréonine en présence de chacun des deux inhibiteurs sont présentées dans le tableau:

L-thréonine (M) Vitesse initiale en présence de D-allothréonine (0,01 M) en mole/min/ml d'enzyme (10 -4) Vitesse initiale en présence de L-isoleucine (0,001 M) en mole/min/ml d'enzyme (10 -5)
0,00100 0,62 3,87
0,00125 0,74 4,54
0,00167 0,95 5,50
0,00250 1,30 7,06
0,00500 2,00 9,60

1/ Calculer les paramètres cinétiques Km et Vmax de l'enzyme pour son substrat utilisé en absence et en présence de chacun des deux inhibiteurs.

2/ Déterminer le type d'inhibition exercée par les deux inhibiteurs.


Réponse

1- Paramètres Km et Vmax de la L-thréonine hydrolyase pour la L-thréonine comme substrat: Km = 0,0029 M, Vmax = 0,0005 mole/min/ml d'enzyme.

- En présence de la D-allothréonine comme inhibiteur:

enzyme thtéonine hydrolyase

- En présence de la Isoleucine:

Isoleucine et thréonine déshydratase

2- Paramètres cinétiques Km et Vmax de l'enzyme pour son substrat utilisé en absence et en présence de chacun des deux inhibiteurs (Km' et Vmax' = constantes en présence d'un inhibiteur):

  Vmax (mole/min/ml d'enzyme) Km (M) Type d'inhibition vis à vis de L-thréonine
L-thréonine seule 0,000500 0,00290 -
En présence de D-allothréonine 0,000500 0,00625 compétitive
En présence de L-isoleucine 0,000153 0,00290 non compétitive


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- Structure des Protéines. Exercice
- Protéomique

Sciences et vie, Biochimie


Enzymologie de la carboxypeptidase

La carboxypeptidase (E.C.3.4.17.1) est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse de la carboxyphénylalanine comme substrat. Son étude cinétique avec le substrat seul ou en présence du phényl-butyrate ou du benzoate, donne les vitesses initiales suivantes:

 
Vitesse initiale (unités)
Carboxyphénylalanine (M)

Substrat seul

Avec Phényl-butyrate (0,002 M) Avec benzoate (0,05 M)
0,0125 133 28,5 -
0,0175 - - 30,3
0,0250 167 50,00 33,3
0,0400 - 71,5 -
0,0500 190 - 38,4
0,0550 - 90,9 -
0,1000 205 - 40,8

1- Déterminer les constantes cinétiques Km et Vmax de la carboxypeptidase en absence des inhibiteurs.

2- Calculer Km et Vmax de l'enzyme en présence des inhibiteurs.

3- Quels types d'inhibiteurs constituent le phényl-butyrate et le benzoate vis à vis du substrat, la carboxyphénylalanine.

4- Calculet les constantes Ki pour chaque inhibiteur.


Réponse

1- les constantes cinétiques Km et Vmax de la carboxypeptidase en absence des inhibiteurs: Km = 8,35 mM, Vmax = 222 unités.

2- En présence du phényl-butyrate: Km' = 98,9 mM, Vmax' = 250 unités (considérée proche de 222 unités (= Vmax))

- En présence du benzoate: Km' = 8,11 mM (considérée proche de 8,35 mM (= Km)), Vmax' = 44,3 unités

3- Types d'inhibition: Phényl-butyrate = inhibiteur compétitif vis à vis de la L-thréonine
- Bensoate = inhibiteur non compétitif vis à vis de la L-thréonine

4- Valeurs de la constante d'inhibition:

- Pour phényl-butyrate: Km a augmenté du facteur (1 + (I/Ki), donc: Km' = Km x (1 + (I/Ki)) c'est à dire: 98,9 = 8,35 (1 + (0,002/Ki)), donc: Ki = pour phényl-butyrate = 0,2 mM.
- Pour le benzoate: Vamx a diminué du facteur (1 + (I/Ki), donc: Vmax' = Vmax / (1 + (I/Ki)) c'est à dire: 44,3 = 222 /(1 + (0,05/Ki)), donc: Ki = 12,4 mM


Enzymologie de la créatine kinase (adapté à partir de Lafont et al. Exercices de Biochimie)
La créatine phosphokinase (CPK) est une enzyme présente dans les cellules musculaires. Elle catalyse la réaction suivante:

Créatine + ATP <------> Créatine-phosphate + ADP

1- La purification de la CPK à partir du muscle squelettique de lapin a été faite selon le protocole suivant:

Extraits Etapes Protéines (mg) Activité totale (UI)
E1 Broyage et homogénéisation de muscle squelettique de lapin 40000 189000
E2 Surnageant de centrifugation après précipitation par NH4Cl à pH = 9,0 9050 179000
E3 Surnageant de centrifugation après précipitation par MgSO4 3250 143000
E4 Précipitation par l'éthanol à froid. Dissolution du précipité dans une solution de citrate d'ammonium 2970 138000
E5 Dialyse 2480 129000
E6 Cristallisation à -10°C 2150 112500

- Calculer le taux de purification pour les extraits E5 et E6 par rapport à E1
- La dernière étape est-elle indispensable ?

2- Etude de la cinétique de la CPK.

On mesure la vitesse initiale (vi) de la CPK en fonction de concentrations croissantes d'ATP (= substrat S). La concentration en créatine étant constante. Les résultats sont indiqués dans le tableau suivant:

ATP (mmol.dm -3) vi (mole de produit apparu/seconde)
0,20 1,36
0,27 1,70
0,41 2,22
0,79 3,12

- Déterminer les paramètres cinétiques Km et Vmax de la CPK pour l'ATP.

- Sachant que la constante Km de l'enzyme pour la créatine est de 0,019 mol.dm -3, comparez les affinités respective de la CPK pour les deux substrats. Les quantités d'ATP et de créatine par gramme de tissu musculaire sont 4 µmol/g et 25 µmol/g, respectivement.

3- Effet du Zinc sur l'activité de la CPK

La vitesse initiale de l'enzyme est mesurée en absence et en présence de deux concentrations de Zn++ (C1 et C2). Les résultats sont indiqués dans le tableau suivant:

ATP (mmol.dm -3)
vi (mole de produit apparu/seconde)
Zn++ = C1 mol.dm-3 Zn++ = C2 mol.dm-3
0,20 1,00 1,16
0,27 1,23 1,45
0,41 1,61 1,89
0,79 2,27 2,70

Comment se comporte le Zn++ vis avis de l'ATP ?


Réponse

1- Tableau de purification de la créatine phosphokinase.

Extraits AS (U/mg) Taux de purification Rendement (%)
E1 4,725 1 fois 100
E2 19,78 4,19 fois (= 19,79/4,725) 94,71 (= (179000/189000) x 100)
E3 44 9,31 fois 75,66
E4 46,46 9,83 fois 73
E5 52 11 fois 68,25
E6 52,33 11,07 fois 59,52

Avec ce protocole de purification, la créatine phosphokinase a été purifiée 11 fois avec une perte de 31,75% (= 100 - 68,25) (étape E5). En ajoutant l'étape E6, on perd plus d'enzyme sans gain dans la purification par rapport à l'étape précédente. Donc, la dernière étape n'est pas indispensable.

2- Etude de la cinétique de la CPK.

- Paramètres cinétiques Km et Vmax de la CPK pour l'ATP (voir courbe ci dessous): Km = 0,57 mM, Vmax = 5 mol/s

- L'affinité de l'enzyme pour l'ATP est plus grande que celle pour la créatine

3- Effet de Zn++ sur l'activité de la CPK: Zn++ est inhibiteur compétitif vis à vis de l'ATP

creatine phosphokinase


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