biochimie. Cours, techniques et applications en biotechnologies

Enzymes, الأنزيمات. Paramètres Km et Vmax et effet des inhibiteurs réversibles

Les enzymes (الأنزيمات) sont caractérisées par leur paramèytres cinétiques Km et Vmax qui renseignent sur leur spécificité vis à vis des substrats


Liens utiles: Enzymologie-enzymes. Exercices -- Enzymes, métabolisme. Exercices --- Inhibiteurs d'enzymes. Exercices ----
French
Arabic

English
Enzymes, inhibiteurs

أنزيمات،  مثبطات

Enzymes, Inhibitors

Enzymes. Phosphatase alcaline

La phosphatase alcaline catalyse l'hydrolyse des esters phosphates en milieu basique. L'étude de cette enzyme pour l'hydrolyse du paranitrophénylphosphate (PNPP) en absence ou en présence de phosphate inorganique (PNPP ---> PNP + P), a permis d'obtenir des vitesses enzymatiques résumées dans le tableau suivant:

 
v (µmoles/min)
(PNPP) mM Sans inhibiteur (P): 0,5 mM (P): 1 mM
0,2 1,78 1,32 1,05
0,3 2,18 1,70 1,39
0,4 2,46 1,98 1,66
0,5 2,67 2,21 1,88
0,6 2,82 2,39 2,06
1,0 3,20 2,84 2,56

Dterminer le type d'inhibition exercée par le phosphate vis à vis du PNPP. Calculer la constante d'inhibition

Réponse

Phosphatase alcaline

Km = 0,249 mM pour le substrat PNPP, Vmax = 4 µmoles/min

Effet du phosphate: Inhibition compétitive: Ki = 0,8 mM

Ici l'inhibiteur fait augmenter Km d'un facteur (1 + (I)/Ki). Donc KmI = Km.(1 + (I)/Ki). Par contre, Vmax reste inchangée; VmaxI = Vmax.

Plus d'explications sur l'inhibiteur compétitif dans la page 76 du livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes' , Baaziz, 2013.


دراســــة أنزيــم بيتا كلكتوزيــداز (β-galactosidase)

تعتبر بيتا كلكتوزيداز (β-galactosidase, β-gal) أنزيما لحلمأة بيتا كلكتوزيدات (β-galactosides) مثل اللاكتوز أو سكر الحليب (Lactose)، إلى سكريات أحادية (Monosaccharides). عند بكتيريا Escherichia coli (E.coli) ، تمت دراسة حركية أنزيم β-gal باستعمال ستة تركيزات (معبر عنها ب M) من o-nitrophényl-galactoside (ONPG) ، كمادة أساس اصطناعية (Substrat synthétique, S )، بحضور و غياب أحد المثبطات الثلاثة  من قبيل o-nitrophényl-β-D-thiogalactoside (ONPTG) ، كمثبط اصطناعي (Inhibiteur synthétique) بتركيز 3.10-4 M ، سكر الشعير (المالتوز، Maltose) بتركيز 0,26 M و سكر الميليبيوز (Mélibiose) بتركيز 0,17 M. بعد القيام بقياسات السرعة الأولية للأنزيم  (إمتصاص الأشعة في الموجة بطول 410 نانومتر في الدقيقة، absorbance à 410 nm, A.min-1) في جميع الحالات و تحت ظروف 25°C و  pH 7,7، أتت النتائج كالتالي:

v مع الميليبيوز (0,17 M) v مع المالتوز (0,26 M) v مع ONPTG (3.10-4 M) v بغياب المثبط (S) M
0,027 0,0165 0,018 0,033 2,5 10-5
0,041 0,0275 0,033 0,055 5,0 10-5
0,055 0,041 0,055 0,0825 1,0 10-4
0,069 0,059 0,091 0,118 2,5 10-4
0,075 0,069 0,118 0,138 5,0 10-4
0,079 0,075 0,138 0,150 1,0 10-3

من خلال رسم منحنيات Linweaver-Burk (1/v = f(1/(S))، بغياب المثبطات (I) و بحضورها، حدد نوعية المثبطات الثلاثة لأنزيم بيتا كلكتوزيداز عند بكتيريا E-coli مع احتساب الثوابت الحركية مثل السرعة القصوى  بغياب المثبط(Vmax) و بحضوره (Vmax’) و ثابت ميكايلس بغياب المثبط  (Km) و بحضوره (Km). ناقش وقع كل مثبط على نشاط أنزيم بيتا كلكتوزياز و العلاقة الترابطية بين الأنزيم (E) و مادة الأساس (S) و المثبط (I).

2) احتسب ثابت أو ثوابت الإعاقة لكل مثبط (Ki و Ki) و قارن ألفة الأنزيم لكل مثبط.

الجـــــواب  

1. حتى نتمكن من رسم منحنيات  Linweaver-Burk (1/v = f(1/(S))، نبدأ باحتساب المقادير المقلوبة  (Inverses) لتركيزات مادة الأساس ONPG (معبر عنها ب S) و السرعة الأولية (v) في شكل 1/(S) و  1/v. بالامكان استعمال برامج الحاسوب المختصة  في هذا الميدان. رسم منحنى معادلة لينفيفر-بورك، طريقة أخرى لتفادي صعوبة تقدير Km و Vmax، انطلاقا من منحنى ميكايليس-مانتان (v = f((S)). تعرف معادلة لينويفر-بورك ب 'المقلوب الزوجي' (Double inverses) ، إذ أنها توضح العلاقة بين مقلوب السرعة (1/vi) ومقلوب التركيز (1/(S)) وفقا لمقلوب معادلة ميكايليس-مانتان:

1/vi = (Km/Vmax).1/(S) + 1/Vmax



Recherche rapide dans ce site et les sites liés de l'auteur (Fr, Ar, Eng) - بحث سريع في هذا الموقع و المواقع المرتبطة للمؤلف :





في حالة اشتغال الأنزيم بحضور أحد المثبطات الأنزيمية الثلاثة، نرسم المنحنيات المناسبة لاستخراج مقادير Vmax و Km’ .

اعتمادا على الرسم ، نكتشف أن  ONPTG يشتغل كمثبط عكسي تنافسي (Inhibiteur réversible compétitif) بالنسبة لمادة الأساس (ONPG)، إذ يقوم بخفض ألفة (Affinité) الأنزيم تجاه مادة الأساس (يقلل ارتباط الأنزيم ب  ONPG) بدون أن يؤثر على السرعة القصوى (Vmax). كما هو معروف لذا المثبطات العكسية التنافسية، انخفاض ألفة الأنزيم مرتبط بارتفاع Km، حيث تصبح بحضور المثبط كالتالي: Km' = Km.(1 + (I)/Ki).، مع (I) يساوي تركيز المثبط و Ki يرمز إلى ثابت الإعاقة. يعود عدم تأثير المثبط على السرعة القصوى إلى عدم تكون معقدات ثلاثية (Complexes ternaires) بين الأنزيم و مادة الأساس و المثبط.

إنطلاقا من الرسم ، يظهر أن سكر الشعير (Maltose) يشتغل كمثبط غير تنافسي (Inhibiteur non compétitif) بالنسبة لمادة الأساس (ONPG)، إذ لا يغير ألفة الأنزيم تجاه مادة الأساس، لكنه يقوم بخفض السرعة القصوى.

المالتوز (Maltose, 2 Glc)، مثبط غير تنافسي تجاه  ONPG، يرتبط بنفس الألفة مع الأنزيم في شكليه E و ES، حيث لا يحدث أي تغير على  Km بينما يخفض Vmax، لتصبح:

Vmax’ = Vmax/ (1 + (I)/Ki)

الميليبيوز (Mélibiose, Gal + Glc) يختلف عن المالتوز بوجود الكالكتوز و الرابطة الكليكوزيدية   α1-> 6. عوض الرابطة  α1-> 4. لكونه مثبطا لا تنافسيا، لا يرتبط الميليبيوز إلا مع الأنزيم المرتبط مسبقا بمادة الأساس، أي  ES.

Correction détaillée dans le livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes' avec DVD, Baaziz, 2013, page 139-144.



Enzymes, Proteines

Accueil ---- Liens-utiles --- Annonces --- Newsletter --- Contact

- -
Enzymes, Km, Vmax, الأنزيمات -