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Inhibiteurs des Enzymes, مثبطات الأنزيم

Les inhibiteurs réversibles des enzymes (مثبطات الأنزيم) sont de différents types (compétitifs, non cométitifs, incompétitis et mixtes.


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Enzymes, inhibiteurs

أنزيمات،  مثبطات

Enzymes, Inhibitors

Inhibiteurs de L'enzyme de conversion de l'angiotensine (ECA)

L'enzyme de conversion de l'angiotensine (enzyme de conversion (ECA, EC 3.4.15.1) est une exopeptidase qui catalyse la conversion de l'angiotensine I en angiotensine II, un puissant vasoconstricteur.

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu
---
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
Angiotensine I
 
Angiotensine II

les inhibiteurs de l’ECA entraînent un relâchement des vaisseaux sanguins, ce qui diminue la pression artérielle. Ainsi, le cœur n’a pas besoin de travailler aussi fort pour envoyer le sang dans tout le corps. Ces inhibiteurs sont des médicament. Les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine I présentent pour la plupart un motif structural commun apparenté au dipeptide L-Alanyl-L-Proline.
Des études de relation structure-fonction ont permis l’émergence de puissants inhibiteurs à partir d’une série représentée par le composé 1 (figure cidessous). L’activité inhibitrice de ces produits est évaluée par leur concentration inhibitrice 50% (CI50) en µM (voir tableau, source: http://www.remede.org).

Composé CI50 (µM)
1 2,400
2 0,040
3 0,001
4 0,800
5 0,028
6 0,016

1/ Pourquoi la configuration des carbones chiraux a-t-elle une influence déterminante sur l’activité de ces molécules ? Combien de centre(s) d’asymétrie les molécules 3 et 4 présentent-elles ?

2/ En comparant les structures des composés 1 à 3, quelle propriété physicochimique se trouve modifiée ? Justifier son influence sur l’activité de ces molécules.

3/ Comparer et commenter les activités pharmacologiques des composés 3 et 4.

4/ Le composé 3 est le métabolite actif de l’énalapril. Quelle différence structurale
existe-t-il entre le composé 3 et l’énalapril ? Concernant l’énalapril, comment appelle-t-on ce type de composé et quel est l’intérêt de cette modification chimique ?

5/ Les composés 5 et 6 résultent du remplacement de la L-proline par un système
bicyclique. Quelle est la conséquence de cette modification sur le plan conformationnel ?

Réponses

1/ La configuration des carbones chiraux joue sur la géométrie des parties actives de la molécule. En effet, l'interaction entre ces molécules et le site catalytique de l'enzyme est stéréo-spécifique. Les molécules 3 et 4 présentent 3 centres d'asymétrie (voir les notions de chimie).

2/ L'introduction sur la chaîne d'un substituant -benzyle (composé 2) et surtout -phényléthyle (composé 3) augmente la lipophilie des molécules qui favorise l'interaction hydrophobe au niveau de la poche S1 lipophile de l'enzyme, ce qui renforce l'affinité et donc leur activité inhibitrice (CI50 inférieures).

Complexe ECA-Angiotensine

3/ Dans le composé 4, la stéréochimie du centre de chiralité est inversée, l'interaction hydrophobe avec la poche S1 est donc fortement réduite, ce qui se traduit par une activité 800 fois plus faible que celle du composé 3 (CI50 800 fois plus grande).

4/ Le composé 3 est utilisé sous forme de monoester éthylique. Cet ester est moins ionisé ce qui permet une meilleure résorption. Il est transformé par les estérases hépatiques. L'énalapril constitue une prodrogue.

5/ La création d'un seul cycle lactame a pour conséquence de figer la chaîne dans la conformation la mieux appropriée au regard des sites d'action de l'enzyme


 


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En abaissant la tension, les inhibiteur de l’ECA donnent des vertiges. Ces derniers sont fréquents avec tout médicament qui diminue la pression artérielle. Cependant, le cœur peut fonctionner plus efficacement quand la pression artérielle est moins élevée

Angiotensine, vasoconstriction


Inhibiteurs de L'enzyme D-Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase

La D-glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase de muscle de lapin est un tétramère de poids moléculaire 136000, constitué de quatre sous-unités identiques portant chacun un site actif. L'enzyme catalyse la réaction suivante :

D-Glycéraldéhyde-3-phosphate + NAD+ + Pi <====> 1-3-diphosphoglycérate + NADH+

Les vitesses initiales (exprimées en variation d'absorbance par minutes, delta A340 min-1) obtenues pour différentes concentrations de NAD+ et mesurées par l'apparition de NADH à 340 nm (Coef.extinction molaire = 6220 M-1 cm-1) sont présentés en absence (v) et en présence (v') de 10-8 M d'inhibiteur, l'acide iodoacétique.

NAD+ (µM) 6 10 20 50 100 200
v (A340/min) 0,034 0,051 0,082 0,125 0,156 0,178
v' (A340/min) 0,017 0,025 0,041 0,062 0,078 0,088

a. Déterminer les paramètres cinétiques de l'enzyme.
b. Quelles conclusions déduisez-vous de l'expérience avec l'acide iodoacétique, sachant que la concentration de l'enzyme dans les 2 expériences, exprimée en tétramère, est de 5 x 10-9 M. Information: l'iodoacétate peut former une liaiso, covalente avec l'enzyme.

Réponses

La détermination de Km et Vmax par la courbe de Michaelis ne peut être faite avec précision, car, cela nécessite l'obtention d'un plateau dans les représentation v = f((S)). La linéarisation sous forme 1/v = f(1/((S)) permet d'avoir plus de précision.

GPDH. Inhibiteur iodoacétate

Les droites des inverses (représentations de Lineweaver-Burk) donnent des vitesses maximales en absence (Vmax) et en présence (Vmax') d'inhibiteur différentes avec des Km identiques. En effet, les deux droites se rencontrent sur l'axe des abscisses au point égal à - 1/ Km qui est égal à 0,03375, ce qui donne une valeur de Km égale à 29.8 µM. 1/Vmax = 5, soit un Vmax égal à 0,2 A/min. 1/Vmax' = 10, ce qui donne Vmax' = 0,1 A/min.

l'inhibition par l'acide iodoacétique exercée vis à vis de NAD+ est une inhibition non compétitive. Mais, ce n'est pas le cas et nous sommes en présence d'une inactivation partielle de l'enzyme qui a lieu suite à une fixation covalente entre l'enzyme et l'inhibiteur. Ainsi, l'enzyme qui réagira avec le substrat est celui qui n'a pas réagi avec l'inhibiteur.

Si [Io] < [Eo], la concentration d'enzyme actif restant sera :

(E0)' = (E0) - (I0), Vmax' = k2(E0)' = k2[(E0) - (I0)]
Exprimons la concentration par monomère : 5 x 10-9 M x 4 = 2 x 10-8 M.
Pour une réaction covalente entre deux corps chimiques A et B, les concentrations de A et B qui vont se lier sont identiques. Ainsi, après incubation en présence d'inhibiteur, la concentration en site actif (Eo)' est égale à 10-8 M. Donc: Vmax' = k2(E0)' = k2(E0)/2 = Vmax/2

En effet, nous constatons que la vitesse maximale ainsi que toutes les vitesses enregistrées en présence d'acide iodoacétique sont égales à la moitié des vitesses obtenues en son absence. Ainsi, l'acide iodoacétique induit une inactivation partielle de l'enzyme.


Inhibiteur de l'acétylcholine estérase

L'acide 1-anilino-8-naphthalene sulfonate (ANS) est un inhibiteur de l'acétylcholine estérase. Pour déterminer la nature de l'inhibition, on a mesuré les vitesses initiales d'hydrolyse de l'acétylcholine (ACH), à différentes concentrations de ce substrat, en absence d'ANS (sans A), en présence d'ANS aux concentrations de 1,07 x 10-4 M et 2,05 x 10-4 M d'ANS. Le tableau suivant donne les vitesses initiales exprimées en µM d'acétylcholine hydrolysé par minute et par mg de protéine et obtenues en absence et en présence d'inhibiteur.

 
v (µmoles/min/mg protéines)
(ACH) mM Sans ANS ANS 1,07 x 10-4 M ANS 2,05 x 10-4 M
0,165 66 35 40
0.220 82 39 45
0,330 107 44 52
0,450 130 47,5 56,5
0,550 143 49,5 59
0,660 156 51 61

Déterminer les paramètres cinétiques (Km et Vmax) de l'acétylcholine estérase et le type d'inhibition qu'exercce l'ANS vis à vis de l'ACH. Dterminer la constante de dissociation du complexe Enzyme-Inhibiteur (Ki).


Réponse

D'après les valeurs des vitesses, on constate qu'en augmentant la concentration d'inhibiteur la vitesse augmente, mais sans atteindre les vitesses obtenues en absence d'inhibiteurs. Pour connaître le type d'inhibition exercée par ANS vis à vis du substrat qui est l'acétylcholine (ACH), on trace les courbes 1/v = f(1/(S)) (représentation de Lineweaver-Burk).

acétylcholine estérase. Inhibiteur ANS


Les droites des inverses (1/v = f(1/(S)) sont parallèles indiquant que l'inhibition par l'ANS est incompétitive vis à vis de l'ACH. La droite (sans inhibiteur) obtenue en absence d'ANS permet de calculer les valeurs de Km ( = 0.236 mM) et de Vmax (= 171µM) d'acétylcholine hydrolysé par minute et par mg de protéine).
Le calcul de Ki peut se faire grâce aux valeurs de Vmax et / ou Km obtenues en présence de l'inhibiteur. En effet l'inhibiteur incompétitif se fixe uniquement sur la forme de l'enzyme complexée avec le substrat (inhibiteur conditionnel). Il va stimuler son interaction avec le substrat en augmentant l'affinité (Km diminue). Cependant, l'inhibiteur fait diminuer Vmax, car il forme un complexe ternaire ESI non déplaçable par excès de substrat.

Inhibiteurs. Types

En présence d'inhibiteur: Km' = Km/(1 + (I)/Ki) et Vmax' = Vmax/(1 + (I)/Ki)

Exemple de calcul avec la concentration de ANS = 1,07 x 10-4 M:

1/Vmax' = 0,0119 µmole-1.min.mg ce qui donne Vmax' = 84,033 µmoles/min/mg protéines.

84,033 = 171/(1 + 1,07 x 10-4/Ki), ce qui donne Ki = 1,033 x 10-4 M



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Enzymes, Km, Vmax, الأنزيمات -