Les enzymes, catalyseurs biologiques, sont essentielles pour la vie. Connaître comment elles assurent la catalyse renvoie à l'élucidation de leur mecanisme, sans oublier que cela se passe par le contact du substrat avec l'enzyme à travers quelques acides aminés qui constituent le 'site actif'. L'enzymologie est l'étude des mecanismes catalytiques (ordre de fixation des substrats et de libération des produits et détermination des paramètres cinétiques). Ci dessous des exemples d'études qui font l'objet d'exercices.

* Quels sont les mécanismes de catalyses susceptibles de rendre compte de ces cinétiques.
La même réaction a été effectuée en présence d'un analogue structural d'un des substrats (I), utilisé à une concentration de 2 mM. Les résultats suivants ont été obtenus (tableau 'enzyme en présence d'inhibiteur').

1. Déterminer le type d'inhibition exercée par I vis à vis de A et de B. De quel substrat l'inhibiteur est t-il analogue ?
2. Déterminer le mécanisme de catalyse précis et les paramètres cinétiques correspondants.
3. Retrouver l'expression de la vitesse en fonction de Ki (constante d'inhibition et de la concentration de I.
4. En déduire la valeur de Ki.

Exercice 2
On se propose de déterminer le schéma réactionnel de la réaction catalysée par l'hexokinase de levure:

Glucose + ATP-Mg <--> Glucose 6-Phosphate + ADP-Mg

Les résultats de l'étude des inhibitions par les produits de la réaction dans le sens de la formation du Glucose-6-Phosphate et l'ADP-MG, comme produits sont représentés par les figures suivantes :

:

1. Quels sont les mécanismes de catalyse susceptibles de répondre à toutes ces données cinétiques ?
2. Déterminer les paramètres cinétiques de l'hexokinase de levure ?
La fixation du glucose et de l'ATP-Mg sur l'hexokinase a été suivie par dialyse à l'équilibre. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableaux ci-dessus:
* Que pouvez vous conclure ?
* Déterminer lorsque c'est possible, le nombre de sites et la constante de dissociation du complexe enzyme-substrat, sachant que les expériences sont réalisées à pH 8,9 ET 30°C avec une concentration d'enzyme égale à 35 µM.

Exercice 3

On étudie le mécanisme réactionnel de la réaction catalysée par la coenzyme A transférase:
succinyl CoA + Acétoacétate <---> Succinate + acétoacétyl CoA
Les vitesse initiales (sens de la formation du succinate comme produit) pour différentes concentrations en substrats sont données dans le tableau ci-dessous. Elles sont exprimées en nanomoles de produit apparu par minute et par mg d'enzyme. La réaction est effectuée à pH 8,10 et à 25°C.

Les résultats de l'étude des inhibitions par le succinate et l'acétoacétyl-Coa sont représentés dans les figures suivantes (à gauche):

/

1. Déterminer le mécanisme réactionnel de la coenzyme A transférase.
2. Déterminer les paramètres cinétiques de cette enzyme.

Cette enzyme (Coenzyme A transférase) a été ensuite utilisée dans 3 expériences :

Expérience 1.
L'enzyme (3,7 x 10-6 M) est incubée à pH 7,4 et 25°C en présence d'acétoacétyl-CoA à la concentration de 4,0 X 10-3 M. Le mélange est ensuite chromatographié à +4°C sur une colonne de Sephadex G-50 (1.5 X 15 cm).
Expérience 2.
L'expérience 1 est réalisée en présence d'acétoacétyl-CoA marqué au 14C sur la partie acétoacétate.
Expérience 3.
L'enzyme est incubée avec le CoA seul .
Les résultats obtenus dans toutes les expériences sont résumés dans la figure ci-dessus (à droite). La présence de l'enzyme recueillie dans les différentes fractions sortant de la colonne, est révélée par mesure de l'activité enzymatique. La présence du CoA est montrée par mesure de la radioactivité.
Une expérience analogue à la première mais réalisée en présence du succinyl-CoA à la place d'acétoacétyl-CoA, donne le même profil d'élution que celui de l'expérience 1.
*Interpréter les résultats obtenus.

Expérience 4. la fraction la plus riche en CoA transférase (tube 4 de l'expérience 1), obtenue après incubation avec l'acétoacétyl-CoA suivie d'une séparation chromatographique, est mise en présence de succinate radioactif, puis chromatographiée dans les mêmes conditions que précédemment.
* Donner l'allure des profils d'élution de l'enzyme (activité enzymatique) et du CoA.
* Sous quelle forme se trouve le coenzyme A ?

EXERCICE 4.

L'étude d'une amine-oxydase du plasma de boeuf a été entreprise afin de déterminer le mécanisme cinétique de la réaction qu'elle catalyse, l'oxydation de la benzylamine :

Benzylamine + O2 + H2O <---> Benzaldéhyde + NH3 + H2O2

La réaction peut être suivie en mesurant l'augmentation de l'absorbance à 250 nm (due à l'apparition du benzaldéhyde) ou en dosant l'eau oxygénée formée.
1. On a étudié les vitesses initiales de la réaction (exprimées en unités arbitraires) pour différentes concentrations de benzylamine et d'oxygène (premier tableau):

* Déterminer le mécanisme de la réaction.
* Déterminer les constantes de Michaelis pour chacun des 2 substrats et la vitesse maximale de la réaction.
2. Par ailleurs, on a mesuré la formation de benzaldéhyde lorsqu'on a travaillé en conditions anaérobies (deuxième tableau).
* Ces résultats sont ils en accord avec le mécanisme déterminé par les études cinétiques ?

ENZYMES ALLOSTERIQUES. EXERCICES..

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