Phospholipase A2. Mécanisme de catalyse et relation structure-fonction (Examen S5)


La phospholipase A2 coupe la liaison ester en position 2 des phospholipides (1,2-diacylphosphoglycérides), libérant un acide gras et un lysophospholipide.
Examen de l'élément de module 'Relation sructure-fonction dans le métabolisme primaire et éléments de base du métabolisme secondaire des plantes', module 'Biochimie, Génétique et Amélioration des Plantes' du Parcours S5 : 'Biologie Appliquée aux Productions Végétales', Novembre 2012, Durée : 1 heure 15 minutes .......... Corrections brèves


QUESTION 1


Les phospholipases A1, A2, C et D sont des enzymes qui hydrolysent les phospholipides.

Phospholipase A2

A. La phospholipase A2 qui a été découverte, d'abord dans les venins de serpents et d'abeilles puis dans les tissus de mammifères et des plantes (protection contre les pathogènes), coupe la liaison ester en position 2 des 1,2-diacylphosphoglycérides, libérant un acide gras et un lysophospholipide. La réaction catalysée par la phospholipase A2 cytosolique implique la présence d'ions calcium (Ca++). Pour étudier le mécanisme cinétique de cette réaction, les vitesses initiales d'hydrolyse de la dibutyryl-lécithine (DBL) ont été mesurées à différentes concentrations de ce dernier et d'ion Ca++ (substrats, S). L'activité enzymatique est déterminée en effectuant le titrage par la soude de l'acide libéré. Les vitesses sont exprimées en µmoles d'acide libérées par min et par mg de protéine. Les cinétiques 1/v = f(1/(S)) (représentations de Lineweaver-Burk) sont résumées dans les figures 1 et 2 ci-dessous. Les diagrammes secondaires tracés à partir des diagrammes primaires, représentent les variations des intersections des droites 1/v = f(1/(S)) avec l'axe des ordonnées (b) en fonction des inverses des concentrations du substrat maintenu constant.

Phospholipase, Calcium

Fig. 1

Phospholipase, DBL

Fig. 2

Les droites de la représentation 1/v = f(1/(Ca++)) font intersection au dessus de l'axe des abscisses en un point dont la projection sur cet axe est - 0,25 x 105 M-1. Les points d'intersections avec les différents axes des diagrammes secondaires sont respectivement A = 0,2 µmole-1 x min x mg (= C) et B = - 0,031 mM-1.
1. En se basant uniquement sur la cinétique, proposer un ou plusieurs mécanisme(s) de catalyse susceptible(s) de rendre compte de toutes les cinétiques de la phospholipase A2 obtenues avec la dibutyryl-lécithine (DBL) et le calcium.
2. Donner le(s) schéma(s) de Cleland général(aux) correspondant(s).
B. Afin de confirmer le mécanisme de catalyse de la phospholipase A2, les effets inhibiteurs de l'acide butyrique et du baryum ont été étudiés. Ils ont permis d'obtenir les cinétiques résumées dans la figure 3.

Fig. 3

1. Préciser les types d'inhibition exercées par le baryum vis-à-vis du calcium et de la DBL.
2. De quels substrat baryum est-il analogue ?. Justifier.
3. Préciser les types d'inhibitions exercées par l'acide butyrique vis-à-vis du calcium et de la DBL.
4. De quel substrat l'acide butyrique est-il analogue ? Justifier.
5. En s'aidant des types d'inhibition obtenus avec les analogues des substrats, déterminer le mécanisme de catalyse précis de la phospholipase A2. Justifier la confirmation ou l'infirmation de tout mécanisme proposé. Calculer les paramètres cinétiques de la phospholipase A2.
6. Proposer un schéma de Cleland pour le mécanisme de catalyse de la phospholipase A2.


QUESTION 2.


Interpréter brièvement les structures enzymatiques, relatives à la phospholipase A2 et illustrées par les figures 4 et 5 suivantes.

Fig. 4

Phospholipase A2. Complexe inhibiteur

Fig. 5


Corrections brèves
Question 1:

A.1. Interprétation des cinétiques de la phospholipase A2
- Avec Ca++ : Les diagrammes primaires sont sous formes de faisceaux de droites faisant intersection à gauche de l'axe des ordonnée et au dessus de l'axe des abscisses:
- Avec la dibutyryl-lécithine (DBL), la cinétique 1v = f(1/(DBL) est sous forme de droites faisant intersection sur l'axe des ordonnée.
Cescinétiques sont en faveur des mécanismes de catalyse: 1/ Mécanisme au hasard fixation dépendante et 2/ Mécanisme Séquencé.
A.2.Schéma(s) de Cleland général(aux) correspondant(s) aux deux mécanisme: voir le cours
B.1. Préciser les types d'inhibition exercées par le baryum vis-à-vis du calcium et de la DBL: Baryum: inhibiteur compétitif vis à vis du calcium et de la DBL.
B.2. Baryum est un analogue structural du calcium. Même s'il compétitif vis à vis de la DBL, il ne peut être analogue structural de celle ci (structure différente)
B.3. Acide butyrique: inhibiteur incompétitif vis à vis du Ca++ et compétitif vis à vis de la DBL
B.4. L'acide butyrique est analogue structural de de la DBL.


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Réponse à la Question 1 (suite):

B.5. En s'aidant des types d'inhibition obtenus avec les analogues des substrats, le mécanisme de catalyse précis de la phospholipase A2 est un mécanisme séquencé (ordonné) où le substrat directeur est le Ca++. En effet, l'inhibition incompétitive exercée par l'acide butyrique (analogue de la DBL) vis à vis du Ca++ est expliquée par l'absence de fixation de la DBL sur l'enzyme libre. Cette fixation est conditionnée par la fixation du calcium. Le mécanisme au hasard fixation dépendante ne peut être retenu, car l'inhibition par les analogues de substrats est de type mixte. Le mécanisme de catalyse de la phospholipase A2 est un mécanisme séquencé avec les paramètres cinétiques; KsCa = 0,04 mM, KmDBL = 32,26 mM et Vmax = 5 µmole/min/mg.

B.6. Proposer un schéma de Cleland pour le mécanisme de catalyse de la phospholipase A2.
Le schéma de Clelande commence par la fixation de Ca++ suivie par celle de la DBL. On ne dispose pas d'information supplémentaire pour connaître l'ordre de libération des produits (acide gras et lysophospholipide)


Réponse à la Question 2:

La figure 4 montre que la phospholipase A2 est une enzyme à Ca++. L'extrêmité hydrophile du phospholipide est dirigée vers le Ca++ alors que la partie hydrophobe (chaines carbonnées d'acides gras) est orientée vers les résidus aromatiques des acides aminés de l'enzyme (Tyr, Trp, Phe). Cette structure montre l'importance des interactions hydrophobes dans la fixation et l'orientation des phospholipides, substrats de la phospholipase A2.
La figure 5. Le calcium est lié dans le site actif par l'acide aspartique (Asp48); L'extrêmité phosphate de l'inhibiteur est orientée vers le Ca++, alors que l'extrêmité aliphatique est orientée vers des résidus phénoliques des phénylalanine (Phe5, Phe63). D'où la mise en jeu d'interactions hydrophobes.
Pour rappel, la phospholipase A2 coupe les acides gras en position sn-2 des phospholipides. Cette position contient souvent des acides gras polyinsaturés (plusieurs doubles liaisons comme l'acide arachidomique) qui, une fois libérés, contribuent à la formation de plusieurs eicosanoïdes comme les prostaglandines, agent de l'inflammation. La cyclooxygénase (COX) est derrière cette action par un processus de peroxydation. L'aspirine (acide acétylsalicylique), inhibiteur irréversible de la COX, bloque la formation des prostaglandine et met fin à l'inflammation.


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