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Mécanisme de catalyse de la tyrosine kinase . contrôle d'enzymologie

Enzymologie des réactions enzymatiques à plusieurs substrats. Cas de la tyrosine kinase du récepteur de l'insuline et mode d'inhibition par les analogues de substrats.


Université Cadi Ayyad, Faculté des Sciences-Semlalia, Marrakech, Morocco.

Examen de l'élément de module 'Relation sructure-fonction dans le métabolisme primaire et éléments de base du métabolisme secondaire des plantes', MODULE 'Biochimie, Génétique et Amélioration des Plantes', Parcours S5 : 'Biologie Appliquée aux Productions Végétales', Décembre 2015, Durée: 1 heure 15 min


Question 1 /15 points (Réponse 1).

Les sous unités béta (transmembranaires) du récepteur de l'insuline sont dotées d'une activité, tyrosine kinase. Celle ci peut être évaluée en mesurant la phosphorylation d'un peptide de 13 acides aminés renfermant une tyrosine (Peptide-Tyr). La réaction peut être écrite selon l'équation suivante :

Peptide-Tyr + ATP ------ Peptide-Tyr-P + ADP

La phosphorylation du peptide-Tyr (Pep-T) est évaluée en présence de différentes concentrations d'ATP et de Pep-T en présence de 25 ng de récepteurs.

Les vitesses de la réaction sont exprimées en picomoles de peptide phosphorylées par minute.

séparateur

Récepteur de l'insuline, tyrosine kinase

Les cinétiques de la tyrosine kinase sont étudiées en faisant varier, à chaque fois, l'un des substrats tout en maintenant l'autre substrat à une concentration constante. Elles sont représentées par les diagrammes primaires 1/v = f(1/(Pep-T) et 1/v = f(1/(ATP) qui ont l'allure d'un faisceau de droites. Les différentes droites des 2 diagrammes primaires font intersection avec les axes des ordonnées en plusieurs points; bi, pour 1/v = f(1/(Ppep-T) et ci pour 1/v = f(1/(ATP). On en déduit 2 diagrammes secondaires respectifs, bi = f(1/(ATP)) et ci = f(1/( Pep-T) qui correspondent à des droites dont les intersections avec les axes sont résumées dans le tableau suivant :

  bi = f(1/(ATP)) ci = f(1/(Pep-T))
Intersection avec l'axe des ordonnées
(picomole-1.min)
0,53 0,53
Intersection avec l'axe des abscisses
(µM-1)
-0,059 -2,38 x10-3

Les types d'inhibitions exercées par deux analogues structuraux des substrats Pep-T et ATP ont été étudiés. Le peptide-Ser (Pep-S) (un analogue structural du Pep-Tyr où la tyrosine phosphorylable a été remplacée par une sérine) diminue l'affinité de l'enzyme pour le substrat tout en maintenant stable la vitesse maximale de la réaction. Inversement, Il est vis à vis de l'ATP sans effet sur l'affinité de l'enzyme pour le substrat tout en diminuant la vitesse de la réaction.
L'AppNHp (un analogue de l'ATP dans lequel l'oxygène entre les atomes de phosphore béta et gamma est remplacé par un -NH-) est sans effet sur la vitesse maximale de la réaction mais entraîne une diminution de l'affinité de l'enzyme pour l'ATP. Vis à vis du Pep-Tyr, l'AppNHp s'avère un inhibiteur sans effet sur l'affinité de l'enzyme tout en diminuant la vitesse maximale de la réaction.

1. Sans considération des effets inhibiteurs exercés par les analogues de substrats, proposer les mécanismes de la réaction susceptibles de rendre compte des cinétiques de la tyrosine kinase. Justifier votre réponse.
2. Préciser les types d'inhibition exercées par les analogues structuraux des substrats.
3. En s'aidant des types d'inhibition obtenus avec les analogues des substrats, déterminer le mécanisme de catalyse précis de la tyrosine kinase. Donner le(s) shéma(s) de Cleland correspondant(s).
4. Déterminer tous les paramètres cinétiques de la réaction enzymatique.

Question 2 /5 points (Réponse 2).

Quelles sont les conséquences cinétiques (mesurées à travers les paramètres Km et Vmax) qui découlent des interactions moléculaires ci-dessous, mises en évidence pour une enzyme E, son substrat S et un inhibiteur I.

Inhibiteurs enzymatiques

lexique
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Réponses
Réponse 1 (Question 1)

1. Sans considération des données relatives aux types d'inhibition par les analogues des substrats et tenant compte des cinétiques 1/v = f(1/(S) sous forme de faisceaux de droites faisant intersection soit sur l'axe des abscisses soit au dessus ou au dessous du même axe, les mécanismes de catalyse enzymatiques proposés pour l'explication de la cinétique de la tyrosine kinase du récépteur de l'insuline sont:

- Mécanisme au hasard fixation dépendante.
- Mécanisme au hasard fixation indépendante.
- Mécanisme séquencé.

2. Types d'inhibition de la tyrosine kinase du récepteur de l'insuline par les analogues structuraux des substrats:

- L'analogue structural du substrat peptide-Tyr (Pep-Ser) ne peut être que inhibiteur compétitif vis à vis du peptide-Tyr. Par contre, il es inhibiteur non compétitif vis à vis de l'ATP, car il diminue Vmax sans chager la Km.

- L'AppNHp (un analogue de l'ATP) ne peut être que compétitif vis à vis de l'ATP. Cependant, il est inhibiteur non compétitif vis à vis du substrat peptide-Tyr, car diminue Vmax sans chager la Km.

3. Les types d'inhibition par les analogues des substrats (inhibitions non compétitives) sont en faveur d'un mécanisme au hasard, fixation indépendante. Le mécanisme au hasard, fixation dépendante est à éliminer, car il est caractérisé par des inhibitions mixtes par les analogues de substrats. De même le mécanisme séquencé (ordonné) ne peut être retenu, car donnant des inhibitions incompétitives par les analogues de substrats. Donc le mécanisme de catalyse précis de la tyrosine kinase du récepteur de l'insuline est un mécanisme aléatoire (au hasard) à fixation indépendante où la fixation d'un des deux substrats (S1 ou S2) n'influence pas la fixation de l'autre (même chose pour les produits (P1, P2). le shéma de Cleland correspondant peut être résumé comme suivant:

mécanisme au hasard

Plus de détail dans le livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes, 2013, pages 119-120.


Réponse 2(Question 2)

Les conséquences cinétiques (mesurées à travers les paramètres Km et Vmax) qui découlent des interactions moléculaires montrées dans la figure:

- Cas 1 (à gauche de la figure): Linhibiteur I ne peut se fixer que sur le complexe enzyme-substrat (ES). Il ne peut réagir avec l'enzyme seule. Sa fixation reste conditionnée par le substrat (S). Dans cette situation, la constante Ks (Ks = [(E) x (ES)]/(ES), renseigne sur l'affinité vis à vis de S, comme Km) va diminuer, car l'équilibre E + S = = = ES sera déplacé en faveur de ES. Ks diminue d'un facteur (1 + (I)/Ki'). Donc, I fait augmenter l'affinité de l'enzyme vis à avis de son substrat. D'autre par, on note la formation d'un complexe ternaire (ESI) non déplaçable par excès de substrat, d'où diminution de Vmax d'un facteur (1 + (I)/Ki'). I est un inhibiteur incompétitif vis à vis de S. Plus de détail dans livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes, 2013, pages 89-91.

- Cas 2 (à droite de la figure): Linhibiteur I ne peut se fixer que sur la forme libre de l'enzyme (E). Il ne peut réagir avec l'enzyme seule. Dans cette situation, la constante Ks (Ks = [(E) x (ES)]/(ES), renseigne sur l'affinité vis à vis de S, comme Km) va augmenter, car l'équilibre E + S = = = ES sera déplacé en faveur de E. Ks augmente d'un facteur (1 + (I)/Ki'). Donc, I fait diminuer l'affinité de l'enzyme vis à avis de son substrat. D'autre par, on note la formation d'un complexe binaire (EI) déplaçable par excès de substrat, d'où Vmax inchangée. I est un inhibiteur compétitif vis à vis de S. Plus de détail dans livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes, 2013, pages 84-89.


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Tyrosine kinase du récepteur de l'insuline