Biochimie, biotechnologies

Biologie moléculaire. Examen TP, S5 au sujet de la purification et analyse électrophorétique de l'ADN de plasmide

L'extraction de l'ADN du plasmide est réalisée par lyse alcaline. Les plasmides sont utiles pour le clonage. Le séquençage de l'ADN peut être réalisé par la méthode de Sanger.


French
English
Arabic
Plasmide Plasmid بلاسميد
Extraction de l'ADN DNA extraction
إستخلاص ADN
Clonage Cloning إستنساخ

L'ADN (DNA) de plasmide (objet d'examen) est purifié à partir des bactéries E.Coli, par hydrolyse alcaline. Après purification, l'ADN plasmidique est soumis à des digestions par des enzyme de restriction. Sont aspect qualitatif est analysé par électrophorèse sur gel d'agarose.


Avertissement: Une fois les examens et contrôles sont organisés par l'Institution d'origine, celle ci détient possession des archives qui deviennent disponibles sur les supports d'information (dont site web) de l'Institution et sont ainsi rendues accessibles pour aider les étudiants des années suivantes à préparer leurs contrôles et examens. Tout usage dans cette optique reste légal et n'enfreigne pas la loi.
Examen de TP de Biologie moléculaire S5: Janvier 2015, Faculté des Sciences-Semlalia, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Morocco. Cet examen (contrôle) est en rapport avec le TP où les étudiants sont censés connaître les dtails des différentes étapes.
Examen TP de Biologie moléculaire, S5 2015 ( Corrections brèves)

1) Pour réaliser une mini-extraction de l'ADN plasmidique par lyse alcaline à partir d'une culture de bactéries E.Coli DH5 transformées par plasmide (pBluescript), nous avons eu recours à un certain nombre d'étapes en utilisant des réactifs définis. Expliquer brièvement le rôle de chacune des solutions:

- Solution I (Tris-HCl pH 8,0, Glucose, EDTA)
- Solution II ( NaOH et SDS)
- Solution III (Acétate de sodium pH 4,8)
- Ethanol absolu à -20°C

2) On veut digérer 10 µg d'un ADN double brin circulaire. Cet ADN est disponible en solution de concentration 0,5 µg/µl. L'enzyme de restriction est mise à disposition à la concentration de 50 U/µl. Une unité d'enzyme (U) digère 1µg d'ADN en une heure à 37°C. Pour être certain que l'hydrolyse est totale, on utilise l'enzyme 5 fois en excès. Pour avoir une activité enzymatique maximale, le tampon constitué de Tris-HCl 0,1 M, MgCl2 10 mM, NaCl 50 mM (pH 7,5) a été utilisé. Il est disponible 10 fois plus concentré (10X). L'hydrolyse enzymatique est réalisée à 37°C pendant une heure dans un mélange réactionnel de volume 50 µl. En respectant toutes les conditions, compléter le tablrau suivant:

Justifier vos réponses.
- 3) Le plasmide pLX est un plasmide recombinant obtenu par insertion d'un segment d'ADN dans le site HindIII du polylinker du plasmide pBluescript. Afin d'évaluer la taille de l'insert, des électrophorégrammes ont été obtenus:
- Echantillon 1: marqueurs de poids moléculaires. La taille est indiquée en paires de bases (pb)
- Echantillon 2: pBluescript natif (250 ng).
- Echantillon 3: plasmide pLX (250 ng) complètement hydrolysé par une enzyme de restriction, BamHI.
- Echantillon 4: plasmide pLX (250 ng) complètement hydrolysé par une enzyme de restriction, Hind III.
Les résultats de l'électrophorèse sont consignés dans les tableaux suivants:

Echantillon 1: Marqueurs de poids moléculaires:

a) Tracer la courbe étalon (papier semi-log ci dessous):

Echantillon 2, 3 et 4:


b/ A quoi correspondent les 3 bandes observées au niveau de l'échantillon 2 ? correspondant à l'échantillon 2. Qu'en déduisez vous ? (/2).

bande 1: ................ - Bande 2: ............ - Bande 3: ..................
- Quelle est la taille réelle du plasmide pBluescript ? .......................
- Justifier votre réponse: ...................................
- c) Déterminer la taille du DNA de l'échantillon 3. Quel est le nombre de coupures effectuées par BamHI? Qu'en déduisez vous ?
-d) Déterminer la taille des DNA de l'échantillon 4. Quel est le nombre de coupures effectuées par Hind III? Déduire la taille du plasmide plX.
Taille du DNA: bande 1: ............ bande 2: ..................
Nombre de coupures: ............
Taille du plasmide pLX:
A quoi correspondent ces deux fragments? Justifier votre réponse.


Réponses brèves, examen 2015 -- (Retour aux questions de l'examen 2015)
1) Purification de l'ADN du plasmide

- la solution I ( TrisHCl pH 8, glucose et EDTA):
Tris HCL pH 8 : à ce pH l'activité des nucléases est réduite ce qui empêche la dégradation de l'ADN. Le pH basique conserve l'ADN et altère l'ARN. De même, un pH basique peut altérer la paroi cellulaire
Glucose : maintient l'isotonie du milieu, empêche la lyse osmotique.
EDTA : chélate les ions divalents dont le Mg2+ qui est un cofacteur des nucléases. En chélatant Ca++, il dénature les parois
- Solution II (NaOH et SDS):
NaOH :Dénature l'ADN total (plasmide + chromosome) des bactéries. L'ADN plasmidique se dénature mais reste circulaire.
SDS : détergent anionique réagit avec les lipides membranaires en provoquant la dissociation des membranes.
- Solution III (Acétate de sodium pH 4,8):
Neutralise le pH du milieu, les brins d'ADN chromosomique bactérien et une grande partie des protéines précipitent et sont éliminés par centrifugation. L'ADN plasmidique se renature rapidement est reste en solution.
- Ethanol absolu à -20°C:
Précipite l'ADN à -20°C.

2) Hydrolyse de l'ADN:

  Tampon 10X ADN Enzyme Eau distillée
Volume (µl) 5 20 1 24

Justifiez:

Tampon d'hydrolyse: pour passer de 10X à 1X, on dilue 10 fois. Pour préparer 50 µl de mélange réactionnel, on fait une prise d'essai de 50/10 = 5 µl de la solution 10X.

ADN prifié: Comme il faut exposer 10 µg d'ADN à l'hydrolyse enzymatique, il faut prélever 20 µl (= 10/0,5) à partir de la solution d'ADN à 0,5 µg/µl.

Enzyme: La digestion totale de 10 µg d'ADN nécessite 10 unités enzymatiques (1 unité d'enzyme par 1 µg d'ADN). A partir de la solution mère de l'enzyme (50 U/µl), on prélève 0,2 µl (=10/50) de la solution mère. Cependant il faut multiplier ce volume par 5 (enzyme en excès pour hydrolyse totale). Don on prélève 0,2 x 5 = 1 µl.

Eau distillée: Comme le volume total du mélange réactionnel est 50 µl, il faut ajouter 24 µl d'eau (= 50 - (5 + 20 + 1) =

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3) Analyse de l'ADN par électrophorèse:
a) Tracer la courbe étalon:

Plasmide. Poids moléculaire DNA

b) A quoi correspondent les 3 bandes observées au niveau de l'échantillon N°2:

- Bande 1 : F. relachée - Bande 2 : F. linéaire - Bande 3 : Forme superenroulée.
- Taille réelle du plasmide pBluescript ? : 3000 pb
Justification : La taille du plasmide est celle de la F. linéarisée ....> Formes de l'ADN de plasmide

c) La taille du DNA de l'échantillon 3: 5000 pb.
- Nombre de coupures : 1
- Déduction : Taille plX supérieur à la taille de pBS. La différence de taille correspondrait-elle à la taille de l'insert. Taille insert = 5000 - 3000 = 2000

d) Tailles des DNA de l'échantillon 4: bande 1: 3000 pb bande 2 :2000 pb.
- Nombre de coupures : 2
- Taille du plasmide plX : 5000 pb
- Ces 2 fragments correspondents à:
Bande 1 = Vecteur, sa taille est 3000 pb. C'est la taille du pBS
Bande 2 correspond à l'Insert, sa taille est 2000 pb.


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