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Extraction et purification de l'ADN de plasmide, clonage, séquençage. Exercices

L'extraction de l'ADN du plasmide est réalisée par lyse alcaline. Les plasmides sont utiles pour le clonage. Le séquençage de l'ADN peut être réalisé par la méthode de Sanger.


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Plasmide
Plasmid
بلاسميد
Extraction de l'ADN
DNA extraction
إستخلاص ADN
Clonage
Cloning
إستنساخ

Liens utiles: -- Nucléosides, Nucléotides. QCM -- Acides nucléiques. QCM (Fr, Ar) --- DNA electrophoresis on agarose gel --- Purification, analyse DNA du plasmide. Contôle TP 2015 --- Clonage d'un gène --
D'abord, faite les exercices, vérifiez votre score et passer, ensuite aux détails des réponses !!

Exercice 1 (Réponse 1). Interprétation de l'extraction de l'ADN plasmidique par lyse alcaline:

Les techniques les plus courantes de l'extraction et la purification de l'ADN des plasmides par lyse alcaline ont des noms abrégés selon 'miniprep', 'midiprep' et 'maxiprep' (selon le volume de laculture bactérienne). Le but consiste à faire une extraction rapide de l'ADN du plasmide (ADN plasmidique) afin de faire une analyse par digestion via les enzymes de restriction et la séparation par électrophorèse. Les digestions servent à vérifier un clone et/ou établir une carte de restriction.

Expliquer les différentes étapes de l'extraction de l'ADN plasmidique par lyse alcaline comme résumée dans la figure ci contre.


Exercice 2 (d'après http://step.ipgp.jussieu.fr) (Réponse 2). Clonage et analyse de l'ADN recombinant. On souhaite étudier la fonctionnalité d’un gène M d’une bactérie. Pour cela, on essaie de cloner au site EcoRI du vecteur plasmidique pBR330 (voir schéma) un fragment Eco RI-Eco RI d'ADN génomique de la bactérie d’intérêt.

Plasmide pBR330

a- Proposez un protocole de clonage et indiquez comment vous sélectionnez les clones recombinants.

b- Un des plasmides recombinants contenant le gène M (appelé pBM1) est digéré par les enzymes de restriction Bam HI et Eco RI. Après migration et séparation des fragments d'ADN par électrophorèses sur gel d'agarose puis coloration au bromure d'éthidium, on obtient les profils de restriction ci contre.

Donnez la carte de restriction du plasmide recombinant pBM1.

Plasmide. Lyse alcaline


Plasmide recombinant

Exercice 3 (Réponse 3). Carte de restriction d'un plasmide circulaire double brin.

On se propose d'établir la carte de restriction d'un plasmide par deux enzymes de restriction, EcoR I et Pst I. La digestion par les deux enzymes a donné les fragments indiqués dans le tableau ci dessous. Dessiner la carte de restriction du plasmide.

Enzyme
Taille des fragments d'ADN
EcoR I 4,2 3,4      
Pst I 3,6 2,7 1,3    
EcoR I + Pst I 2,2 2,0 1,4 1,3 0,7

Exercice 4 (Réponse 4). Séquençage de l'ADN d'un gène

Pour établir la carte de restriction de l'ADN d'un gène, une solution d'ADN a été réparti en 3 fractions soumises à une hydrolyse avec EcoR I, Hind III et EcoR I + Hind III, respectivement. Les hydrolysats ont été séparés par électrophorèse. La détection des fraguements d'ADN a été réalisée par hybrIdation avec une sonde marquée du gène étudié. Les résultats de l'électrophorèse sont montrés dans la figure ci dessous. Dessiner la carte de restriction de l'ADN du gène.

Restriction (clonage, séquençage)

Exercice 5 (Réponse 5). Séquençage d'un ADN monocaténaire

Soit un ADN monocaténaire dont on décide de déterminer sa séquence nucléotidique primaire. Par hybridation moléculaire, on fixe sur l'extrémité 3' une courte amorce (primer) complémentaire marquée au 32P sur son extrémité 5' et possédant un 3'OH libre. On réalise 4 réactions indépendantes de polymérisation. Les 4 réactions contiennent les éléments suivants :

- ADN monocaténaire avec une amorce fixée.
- dATP, dTTP, DCTP et DGTP.
- DNA polymérase I d'E. coli, enzyme synthétisant une copie d'ADN complémentaire à l'ADN simple brin
- Pour chacune des 4 réactions, on ajoute un des 4 didésoxyribonucléotides triphosphate (ddXTP) ne possédant pas de OH en position 3' (ddATP, ddTTP, ddCYP et ddGTP).

1- Pourquoi utilise-t-on une amorce dont l'extrémité porte une fonction hydroxyle libre ?

2- Sachant que la polymérase utilisée reconnaît également les ddXTP comme substrat, quelle sera la conséquence de l'incorporation dans la chaîne d'ADN néosynthétisée, de ddXTP donné à la place d'un dXTP correspondant ?

3- Les 4 réactions sont réalisées simultanément. Le milieu réactionnel est chauffé ensuite à 100°C, refroidi rapidement puis soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (gel de s"quençage). Après migration, le gel est analysé par autoradiographie.

- Quel est le but de traitement thermique du milieu réactionnel ?
- Après autoradiographie, quelles sont les chaînes nucléotidiques qui seront visualisées.
- A partir de l'autoradiogramme ci dessous, déduisz une partie de la séquence nucléotidique primaire correspondant à l'ADN monocaténaire de départ.

gel sanger

lexique
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Réponses
Réponse 1 (Exercice 1)

- Lyse des cellules par le détergent (SDS) en présence de soude (pH 13) dénaturant l'ADN total (plasmide + Chromosome).

- Neutralisation rapide par addition de l'acétate de potassium (pH 5,5): L'ADN plasmidique se renature tandis que l'ADN chromosomique précipite.

- Concentration de l'ADN plasmidique par précipitation à l'alcool et récupération de l’ADN par centrifugation.

- Suspension de l’ADN plasmidique dans le tampon TE ou l'eau pure.

- Elimination des ARN par les RNases (hydrolyse sélective des ARN/ ADN reste intact).


Réponse 2 (Exercice 2)

a. Protocole de clonage
- Préparation de l'insert: Extraction d'ADN génomique de la bactérie. Digestion partielle de cet ADN par l'enzyme de restriction Eco RI, de manière à générer des fragments de 5 à 10 kb. Electrophorèse préparative pour purifier sur gel les fragments de 5 à 10 kb.

- Préparation du vecteur: Digestion complète de pBR330 par Eco RI. Déphosphorylation des extrémités.
- Clonage: ligature des inserts et des vecteurs. Transformation de cellules d'E. coli. Recommencer les étapes précédentes jusqu'à avoir 10 e+6 colonies transformées indépendantes.
- Sélection: sélection des colonies transformées sur milieu contenant de la streptomycine. Pour estimer le taux de colonies qui ont reçu un plasmide contenant de l'ADN génomique de la bactérie étudiée, repiquage d'environ 500 colonies sur milieu contenant de l'ampicilline: seule les colonies qui ont reçu un plasmide ne contenant pas d'ADN génomique de la bactérie étudiée poussent.
- Sélection des clones contenant le gène d’intérêt: transfert des 10 e+6 colonies sur filtre et hybridation moléculaire avec une sonde appropriée (technique dite de 'hybridation sur colonies')

b. Carte de restriction.

Une carte de restriction (= physique, à ne pas confondre avec une carte génétique) est une représentatio ngraphique de la localisation des sites reconnus par les principales enzymes de restriction sur une molécule d’ADN. A l'aide de la carte, il devient facile de connaitre la taille des fragments d'ADN libérés par digestion par une ou plusieurs enzymes.

Rappel: Un polylinker est une courte séquence portant un grand nombre de site de restriction uniques sur l'ensemble du plasmide et qui permettent d'insérer plus facilement un ADN d'intérêt qu'on appelle insert. Le polylinker sert pour les manipulations de génie génétique. Présentant un polylinker, Un plasmide ou un ADN de bactériophage devient un vecteur de clonage dans lequel on peut insérer un ADN étranger.

Plasmide. Carte de restriction

Exemple de Plasmide artificiel de clonage pBluescript

plasmide pBluescript

On note trois grands domaines fonctionnels: l'origine qui permet la réplication du plasmide, le gène 'ampicillin' qui code pour la résistance à l'antibiotique ampicilline et le gène lacZ qui code pour la ß-galactosidase et permet la détection des cellules transformées. Le site MCS (Multiple Cloning Site) ou polylinker, de courte séquence mais portant un grand nombre de sites de restriction uniques sur l'ensemble du plasmide, permet d'insérer facilement un ADN d'intérêt qu'on appelle insert.


Réponse 3 (Exercice 3). Carte de restriction d'un plasmide circulaire double brin.

EcoR I (2 coupures): 4,2 + 3,4 = 7,6

Pst I (3 coupures): 3,6 + 2,7 + 1,3 = 7,6

EcoR I + Pst I (5 coupures): 2,2 + 2,0 + 1,4 + 1,3 + 0,7 = 7,6

Plasmide. Carte

Réponse 4 (Exercice 4). Séquençage de l'ADN d'un gène.

Carte restriction ADN


Réponse 5 (Exercice 5). Séquençage d'un ADN monocaténaire

- Dans le séquençage par la méthode de Sanger, l'amorce (primer) fourni une extrémité 3' OH libre nécessaire pour l'action de la DNA polymérase.

- Le didésoxynucléotide provoque l'arrêt de l'élongation de l'ADN.

- Le but du traitement thermique est la dénaturation de l'ADN bicaténaire (Matrice + ADN néoformé). Après chauffage, tous les fragments sont monocaténaires.

- Toutes les chaînes nucléotidiques liées à l'amorce sont radioactives (32P) et visualisées par autoradiographie.

- La séquence de l'ADN à séquencer: 5'TCGAAGATGCACCTG3'


Automatisation du séquençage

Les fragments d'ADN résultant de la polymérisation sont marqués grâce à des marqueurs fluorescents. La taille des fragments obtenus est déterminée par une chromatographie au lieu de l'électrophorèse. Le séquenceur détecte la florescence sortant des colonnes de chromatographie (4 colonnes), repérant les fragments d'ADN et leurs tailles précises. Les systèmes les plus modernes permettent même de lire les quatres nucléotides à partir d'une seule colonne de chromatographie.
Le résultat est présenté par la machine sous forme de courbes présentant la fluorescence détectée (et l'équivalent en terme de nucléotides).



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Plasmide. Extraction de l'ADN, clonage et séquençage