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Protéines, peptides. Contrôle S3

Les protéines sont des macromolécules constituées d'acides aminés. Les peptides sont constitués de deux à quelques dizaine d'acides aminés.


Sur cette même page: Examens: Contôle 2007 -- Contrôle de rattrapage 2007 -- Contrôle 2-2006 ---

Contrôle 1 du module 'Biochimie structurale, partie protéines, 2007, Filère 'sciences de la vie', Faculté des Sciences, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Maroc, durée 2 heures)
Avertissement: Une fois les examens et contrôles sont organisés par l'Institution d'origine, celle ci détient possession des archives qui deviennent disponibles sur les supports d'information (dont site web) de l'Institution et sont ainsi rendues accessibles pour aider les étudiants des années suivantes à préparer leurs contrôles et examens. Tout usage dans cette optique reste légal et n'enfreigne pas la loi.

Problème 1.

Au niveau métabolique, le glucose-1-phosphate est transformé en fructose-6-phosphate par deux réactions successives:

Glul-1-P <--> Glu-6-P (delta G°1 = - 7,11 KJ/mole); Glu-6-P <--> Fructose-6-P (delta G°2 = 1,67 KJ/mole).

Calculer la valeur de delta G° de la réaction globale.


Problème 2.

L'ATP joue un rôle central dans les échanges énergénitques des systèmes biologiques.

- Montrer par un exemple, comment l'ATP joue-t-elle ce rôle ?

- Donner le processus qui permet de générer la majorité de l'ATP lors du métabolisme oxydatif.


Problème 3 (Réponse 3).

On veut séparer l'acide glutamique, la leucine et la lysine par chromatographie sur une résine échangeuse de cations. Les points isoélectriques de l'acide glutamique, de la leucine et de la lysine sont respectivement, 3,22, 5,98 et 9,74 à 25°C. On dépose ces trois acides aminés sur la colonne à pH = 2, puis on amène progressivement le pH à 7.

Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ?


Problème 4.

On étudie un peptide P après action d'un agent réducteur (béta-mercaptoéthanol). Deux peptides (A et B) peuvent ainsi être séparés par chromatographie.

Peptide A: après hydrolyse, la composition en acides aminés est la suivante:

Val 1; Ala 2; Ile 1; Cys 1.

La méthode d'Edman donne PTH-Val puis PTH-Ile puis PTH-Ala.

La carboxypeptidase donne Cys

Peptide B: après hydrolyse acide, on détermine la composition globale en acides aminés:

Phe 1; Ala 2; Val 1; Ile 1; Glu 1; Cys 1.

L'action de la chymotrypsine donne deux fragments B1 et B2 de composition:

B1: Ala 2; Ile 1; Phe 1., B2: Val 1; Glu 1; Cys 1.

L'action de la carboxypeptidase sur le peptide B donne Glu

La méthode d'Edman libère un PTH-Val à partir de B2 et deux PTH-Ala à partir de B1.

- Donner le nombre d'acides aminés qui rentrent dans la séquence du peptide P.

- Donner la structure primaire du peptide P.


Problème 5 (Réponse 5).

On veut déterminer le nombre de chaînes polypeptidiques de la molécule d'hémoglobine humaine HbA. Pour l'ensemble de la molécule d'HbA, on ne trouve que la valine comme résidu N-terminal. Pour 100 µg d'hémoglobine, il existe 0,73 µg de valine. Sachant que les poids moléculaires de l'hémoglobine et de la valine sont 64000 et 117, respectivement, combien y-a-t-il de chaînes par molécule d'HbA ? Justifier votre réponse. Quelle est la structure tridimensionnelle de HbA ?


Problème 6.

Donner les différents types de liaisons chimiques mises en jeu dans les structures protéiques suivantes:

- Structure secondaire en hélice
- Structure secondaire en feuillet plissé
- Structure tertuaire
- Structure quaternaire



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Problème 7.

Donner le principe de chacune des méthodes suivantes utilisées pour la purification d'une protéine à partir d'un extrait biologique:

1- Fractionnement par un sel comme le sulfate d'ammonium

2- Précipitation isoélectrique

3- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide dans les conditions dénaturantes par le sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE)

4- Chromatographie d'exclusion ou tamissage moléculaire

5- Chromatographie d'affinité.


Réponses proposées (Contrôle 1 du module 'Biochimie structurale, partie protéines, 2007)
Réponse 3 (Problème 3).

Il s'agit d'une séparation par chromatographie échangeuse d'ions (ici échange de cations).

Lorsque le pH est supérieur au pHi (pH > pHi), l'acide aminé est chargé négativement (forme anionique).

Lorsque le pH est inférieur au pHi (pH < pHi), l'acide aminé est chargé positivement (forme cationique).

Le tableau ci-dessous résume les charges électriques des 3 acides aminés, à pH = 2 et à pH = 7.

Acide aminé pHi Charge à pH 2,0 Charge à pH 7,0
Acide glutamique (Glu) 3,22 + -
L-Leucine (Leu) 5,98 + -
L-Lysine (Lys) 9,74 + +

- A pH = 2, les trois acides aminés sont chargés positivement, et seront retenus lors du passage sur la colonne.

- A pH = 7, seuls Glu et Leu, chargés négativement, seront élués. Lys reste fixé à la colonne.

Glu est élué en premier (pHi = 3,22) suivi de Leu (pHi = 5,98).


Réponse 5 (Problème 5).

Comme il n'y a que l'acide aminé valine (Val) comme résidu N-terminal, la comparaison du nombre de moles de Val et le nombre de moles d'hémoglobine conduira au nombre de chaînes polypeptidiques.

Val: n/M = 0,73/117 µmole = 0,00624 µmole . Hémoglobine: n = 100/64000 µmole = 0,00156 µmole.

0,00624 µmoles de Val -------- 0,00156 µmole d'hémoglobine

x moles de Val -------------------- 1 mole d'hémoglobine

x = 0,00624/0,00156 moles de valine = 4.

Comme chaque mole de Val correspond à une chaîne; le nombre de chaînes polypeptidiques = 4


Contrôle de rattrapage du module 'Biochimie structurale, partie protéines, 2007, Filère 'sciences de la vie', Faculté des Sciences, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Maroc, durée 1 heure)
Partie : Acides aminés - Protéines et Enzymologie ( Durée 1 heure)

1) - On se propose de doser les acides aminés dans une solution biologique par la méthode colorimétrique utilisant la Ninhydrine comme réactif . Sachant que l'absorbance de la solution a une valeur de 0,4 , le coefficient d'extinction moléculaire est de 1 mM-1.cm-1 et le trajet optique est de 1 cm. Quelle est la concentration de la solution analysée en acides aminés ?

2) - Donner la méthode utilisée pour séparer un mélange d'acides aminés en se basant sur leur différence de charge électrique au pH de la solution tampon.

3) - Soit un mélange de 3 peptides :
P1 = His-Gly-Pro-Lys
P2 = Glu-Leu-Cys-Asp
P3 = Ala-Gly-Ile-Ser
*On soumet ce mélange à une électrophorèse à pH=6. Indiquer par un schéma la position des trois peptides P1, P2 et P3.
*On dépose le même mélange au sommet d'une colonne remplie d'une résine échangeuse de cations , et l'on applique un gradient de pH de 1 à 10. Indiquer l'ordre de sortie des trois peptides.

4) - Une enzyme a été purifiée en trois étapes, à partir de 1 000 g de protéines contenant 20 000 unités enzymatiques. Compléter le tableau en indiquant à chaque étape le degré de purification et le rendement :

  Quantité des protéines ( g ) Activité ( UI )
1- Extrait brut 1 000

20 000

2- Précipité au sel (NH4)2SO4 200 14 000
3-Chromatographie d'exclusion 15 4 500
4-Chromatographie d'affinité 1 1 600

5) Une hydrolyse acide totale d'un polypeptide permet d'obtenir la composition en acides aminés suivante : 1 Gly ; 2 Glu ; 1 Phe ; 1 Leu ; 1 Val 2 Arg ; 1 Tyr ; 2 Cys.
L'action du B- mercaptoétahanol permet d'obtenir deux hexapeptides A et B. Le peptide A, traité selon la méthode d'Edman libère PTH-Gly, puis PTH-Tyr. Les carboxypeptidases A et B sur le fragment A libèrent successivement Arg, et 2 Glu. Le peptide B traité par le dinitrofluorobenzène ( DNFB) libère de la leucine. L'action de la chymotrypsine sur B est positive.et l'analyse spectrophotomètrique indique qu'il absorbe fortement à 280 nm. L'extremité C-terminal de l'hexapeptide B comprend Arg suivie de Val.
Donner une proposition de la structure primaire du polypeptide initial.

6) L'étude de la cinétique d'une réaction enzymatique montre que pour une concentration en substrat égale à 50 mg/ml ( Masse molaire est 200), la vitesse de la réaction est égale à la moitié de la vitesse maximale . Déterminer à partir de ces données la valeur de la constante de Michaelis-Menten Km. Quelle serait l'action d'un inhibiteur compétitif sur cette valeur. ?


Feuille des réponses.

1) Concentration en acides aminés de la solution : ……………………………
2) Méthode de séparation ………………………………………………………
3) - Schéma électrophorètique : …………………………………………………
- Ordre d'élution chromatographique : …………………………………………
4)

  Degré de purification Rendement
1- Extrait brut  

 

2- Précipité au sel (NH4)2SO4    
3-Chromatographie d'exclusion    
4-Chromatographie d'affinité    

5) Structure primaire proposée : …………………………………………………………

6) - Valeur de la constante de Michaelis-Menten : …………..........……………………..

- Action de l'inhibiteur compétitif ……………………………………………………….


Réponses proposées (Contrôle de rattrapage du module 'Biochimie structurale, partie protéines, 2007)
1) Concentration en acides aminés de la solution : Loi de Beer Lambert: DO = kCl, avec k= coefficient d'extinction, C = concentration et l = trajet (en cm). C = 0,4/1x1 = 0,4 mM ... Voir exercices sur Loi de Beer Lambert.

2) Méthode de séparation: Electrophorèse (+ chromatographie d'échange d'ions)

3) Schéma d' électrophorèse: Voir exercice similaire séparation des peptides -- Electrophorèse d'acides aminés.

4).

  Activité spécifique Degré de purification Rendement
1- Extrait brut 20 = 20000/1000 1 fois 100 %
2- Précipité au sel (NH4)2SO4 70 = 14000/200 3,5 fois (= 70/20) 70% (= 100 x 14000/20000)
3-Chromatographie d'exclusion 300 = 4500/15 15 fois (= 300/20) 22,5% (= 100 x 4500/20000)
4-Chromatographie d'affinité 1600= 1600/1 80 fois (= 1600/20) 8% (= 100 x 1600/20000)

Voir exercice similaire sur le tableau de purification des protéines et enzymes.

5) Voir des exercices similaire sur ldétermination de la séquence des protéines.

6) Valeur de la constante de Michaelis-Menten: Km est une concentration de substrat permettant d'avoir Vmax/2. Donc la concentration donnée est une valeur de Km = 50 /200 = 0,25 mmol/L (ou 0.25 mM).

- Action de l'inhibiteur compétitif: L'inhibiteur compétitif va augmenter Km (diminuer l'affinité de l'enzyme pour son substrat) sans changer la vitesse maximale. Voir explications sur l'inhibiteur compétitif

Vidéo sur les inhibiteurs compétitifs (interactions avec l'enzymes, équation de vitesse, représentations graphiques, Exemples d'applications)

Inhibiteur compétitif. Version Ar


Contrôle 2 du module 'Biochimie structurale, partie protéines, 2006, Filère 'sciences de la vie', Faculté des Sciences, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Maroc, durée 1 heure et 30 min)
Partie : Bioénergétique et Enzymologie (Durée = 1h30 ; Note / 14)

Problème 1 :
a) Calculer l'énergie libre de l'hydrolyse de l'ATP en ADP + Pi dans les conditions physiologiques d'un muscle en repos qui sont les suivantes :
ATP = 5 mM ; ADP = 0,5 mM ; Pi = 5 mM à pH 7 et T = 25°C
( G'° = 30,5 kJ / mole ; R = 8,3 J/mole/K)

b) Au cours du métabolisme, des composés existent sous forme de couple redox. On peut exprimer G'° = - n F E'°
n et F étant des constantes , dans quelles conditions ces réactions
d'oxydo-réduction sont elles spontanées ?

Problème 2 :

a) Soit une enzyme à cinétique michaelienne. Tracer sur un même schéma, l'allure générale des courbes V = f (S) :
- en l'absence d'inhibiteur
- en présence d'un inhibiteur compétitif
- en présence d'un inhibiteur non compétitif.
Préciser clairement sur la figure les Km et les Vmax.

b) Les vitesses initiales d'une réaction enzymatique en fonction de concentrations variables en substrat sont données dans le tableau suivant :

Concentration en S (moles/litre) Vi ( micromoles/minute)
1,25 x 10-2 33
1,8 x 10-2 41,5
2,5 x 10-2 50
4 x 10-2 62,5
77 8 x 10-2

- Déterminer Vmax
- Calculer la vitesse initiale pour une concentration en substrat double de Km.


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Protéines, peptides, Examen