Biochimie, biotechnologies

Protéines. Purification (Exercices)

Protéines. Purification (Exercices)


La purification des protéines implique plusieurs techniques dans la chromatographie, la précipitation par les sels, l'électrophorèse, la centrifugation.


Vocabulaire:
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تنقية البروتينات Protein purification Purification des protéines 
كروماتوغرافيا
Chromatography Chromatographie

Question 1.
Quelles sont les raisons d'utilisation de la précipitation au sulfate d'ammonium comme étape initiale de purification d'une protéine?
(Réponse 1)


Question 2. Un mélange de protéines contenant l'ovalbumine (pI 4,6), uréase (pI 5,0), et myoblobine (pI 7,0) est séparé par chromatographie sur une colonne de DEAE-cellulose à pH 6,5. La colonne a été éluée à pH 6.5 avec un tampon de force ionique faible, puis avec le même tampon contenant des concentrations croissantes de chlorure de sodium (NaCl). Déterminer l'ordre d'élution des des différentes protéines (Réponse 2)
Question 3. Expliquer l'utilisation rare d'une chromatographie DEAE cellulose à un pH supérieur à 8,5
(Réponse 3)

Question 4. Justifier le choix d'utilisation de tampons à pH supérieur à 6,0 mais inférieur à 9,0 lors de la chromatographie sur DEAE-cellulose de la 6-phosphogluconate déshydrogénase qui possède un pI de 6 (marge de pH permettant la fixation de l'enzyme).
(Réponse 4).

Question 5. Concernant la purification de l'enzyme 6-phosphogluconate déshydrogénase:
a) L'enzyme pourra-t-elle se lier à une résine de CM-cellulose si on utilise des tampons à pH supérieur à 6,0 mais inférieur à 9,0 ? Justifier votre réponse ?
b) Quel pH approximatif le tampon devra-t-il avoir pour permettre à l'enzyme d'être fixée sur la colonne de CM-cellulose?
(Réponse 5).

Proposer un protocole de purification d'une enzyme de poids moléculaire 24 kDa et de pI 5.5 et qui est contaminée par deux autres protéines, l'une de masse moléculaire analogue et de pI 7.0, et l'autre de poids 100 kDa et de pI 5.4.
(Réponse 6).

(adapté de Eric R. Gauthier, 2007). Un protocole de purification d'une enzyme E d’E. coli comprend les étapes ci-dessous.
a) Calculez pour chaque étape (1) l'activité spécifique, (2) le pourcentage de rendement par rapport à la quantité initiale d'enzyme et (3) le degré de purification (x fois).
b) Indiquez quelle étape permet la plus grande purification de la protéine.
c) Considérant que la protéine est pure après le tamisage moléculaire (Bio-Gel A), quel pourcentage de l'extrait initial était constitué de l'enzymz E?

Étape de
purification
Volume (mL) Protéines
totales (mg)
Activite
enzymatique (microg./min)
1- Extrait cellulaire 2800 70000 2700
2- Sulfate d'ammonium 3 000 25400 2300
3- Dénaturation chaleur 3000 16500 1980
4- Chromato. DEAE 80,00 390,00 1680
5- CM-cellulose 50,00 47,00 1350
6- Bio-Gel A 7,0 35,00 1120

(Réponse 7).


Réponses. Détails
Réponse pour Q1 (Question 1)
La précipitation au sulfate d'ammonium (fractionnement par le sulfate d'ammonium, relargage) exploite le critère de la solubilité des protéines. Elle permet de concentrer la protéine d'intérêt en précipitant de manière non-spécifique une proportion généralement importante des protéines contenues dans l'extrait total. On obtient un extrait brut (purification partielle) de la protéine, qui peut ensuite subir d'autres étapes de purification.

Réponses. Détails (suite)


Réponse pour Q2 (Question 2)
Afin d'éluer des protéines liées sur une résine échangeuse d'ions, deux possibilités sont offertes: 1/ utiliser un gradient de pH ou de sel (généralement du NaCl). Dans la cas où on opte pour l'utilisation d'un gradient de NaCl, on débute généralement avec un tampon de faible force ionique, suivi par une série de tampons dont la concentration en NaCl augmente graduellement (on peut utiliser un formeur de gradient continu). Les ions Na+ ou Cl- décrochent les protéines de la colonne en neutralisant les charges négatives ou positives qui permettent aux protéines d'interagir avec la résine. Le résultat est l'élution des protéines selon leur densité de charge. En effet, pour être décrochées d'une colonne échangeuse de cations (CM-cellulose), les protéines possédant moins de charges positive nécessiteront moins d'ions Cl- (donc une concentration de NaCl moins élevée) pour neutraliser leurs charges que des protéines possédant plus de charges positives.
La même logique s'applique aux ions Na+ lors de l'élution de protéines fixées à une résine échangeuse d'anions (DEAE-cellulose).
Chromatographie échange d'ions
Echange d'anions (DEAE)
Echange de cations (CM)

Dans le cas de cet exercice, on peut conclure que :
- la myoglobine sera éluée la première, car elle ne se fixera pas à la colonne (pH<pI: donc charge nette positive)
- le pI de l'uréase (5,4) est plus rapproché du pH du tampon que le pI de l'ovalbumine (4,6): l'uréase possédera donc une charge globale nette moins négative que l'ovalbumine. On peut donc prédire que l'uréase sera éluée à une concentration de NaCl inférieure à celle requise pour éluer l'ovalbumine.
L'ordre d'élution sera donc: 1: myoglobine (non retenue par la résine), 2: uréase et 3: ovalbumine.

Réponse pour Q3 (Question 3)
Le groupe diéthylamino (-CH2-CH2-NH+-CH2-CH3) du DEAE-cellulose porte une charge positive qui est à la base du fonctionnement de cette colonne. En effet, les acides aminés/protéines chargées négativement vont se lier (via des liaisons électrostatiques) au groupe diéthylamino, alors que les acides aminés/protéines chargés positivement se retrouveront dans l'éluant. Comme le groupe diéthylamino possède un pKa voisin de 8,5, ce groupe sera déprotoné à un pH supérieur à 8,5, ce qui lui enlève toute sa capacité à lier des substances chargées négativement.


Réponse pour Q4 (Question 4)
A un pH supérieur à 6 (pI de la 6-phosphogluconate déshydrogénase), cette enzyme possède une charge globale négative (pH>pI). Elle peut se fixer sur la colonne DEAE-Cellulose. A un pH supérieur à 9, le groupe diéthylamino de la colonne perd son proton, empêchant en même temps toute séparation de l'enzyme selon sa charge.

DEAE Cellulose


Réponse pour Q5 (Question 5)
a) Non, car la CM-cellulose (CM = carboxyméthyl = -CH2-COOH), étant chargée négativement, est une résine échangeuse de cations. A un pH supérieur à 6, la 6-phosphogluconate déshydrogénase se trouve chargée négativement et ne peut donc pas se fixer sur la colonne.
b) Afin de séparer la 6-phosphogluconate déshydrogénase sur une colonne de CM-cellulose, on doit s'assurer que la protéine possède une charge globale positive. Le pH du tampon devra donc être inférieur au pI de la protéine, soit inférieur à 6.
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Réponses. Détails (suite)
Réponse pour Q6 (Question 6)
Un protocole simple et rapide pouvant séparer ces protéines implique d'abord la réalisation d'une chromatographie sur résine échangeuse d'ions. Ceci permet de se débarrasser de la protéine dont le pI est différent de notre enzyme (on joue sur la différence de pI). Dans une seconde étape, on peut effectuer un tamisage moléculaire (chromatographie d'exclusion exploitant le critère de la taille des molécules) afin de séparer notre enzyme (Poids moléculaire 24 kDa) de l'autre protéine contaminante (Poids moléculaire 100 kDa). Des résultats similaires seraient obtenus si l'on effectue d'abord le tamisage, suivi de la
chromatographie sur résine échangeuse d'ions.

Réponse pour Q7 (Question 7)
a) L'activité spécifique est définie comme étant le nombre d'unité enzymatique par mg de protéine. On doit diviser le nombre d'unités enzymatiques déterminées expérimentalement par la quantité de protéine dans l'extrait. Ainsi, pour l'étape du traitement à la chaleur, on aura:
activité spécifique = activité enzymatique / mg protéine
activité spécifique = 1980 U/16500 mg = 0,12 U/mg
Le rendement (en %) est défini comme la quantité d'enzyme (ou de protéine) recueilli après x étapes par rapport à la quantité présente initialement dans l'extrait brut. Il est obtenu en divisant l'activité enzymatique à l'étape x par l'activité enzymatique initiale. Toujours pour l'étape de dénaturation par la chaleur, on aura:
Rendement = act. enzym. étape x / act. enzym. initiale
Rendement = (1 980 U/2 700U) x 100 = 73,3 %
Quant au degré de purification, il est obtenu en divisant l'activité spécifique après l'étape x par l'activité spécifique initiale. On obtient alors le nombre de fois que l'enzyme fut concentrée (purifiée) après les traitements effectués. Pour l'étape de dénaturation à la chaleur, on aura:
Degré de purification = act. spécif. étape x / act. spécif. initiale
Degré de purification = 0,12/0,039 = 3,07 fois.
Les résultats pour chacune des étapes de purification sont indiqués dans le tableau ci-dessous:

Étape de
purification
Activité spécifique
(U/mg)
Rendement (%) Degré de
purification
(n fois)
1- Extrait cellulaire 0,039 (= 2700/70000) 100 1
2- Sulfate d'ammonium 0,090 (= 2300/25400) 85,20 (= 2300/2700) x 100 2,30 (= 0,09/0,039)
3- Dénaturation chaleur 0,12 73,30 3,07
4- Chromato. DEAE 4,31 62,20 110,50
5- CM-cellulose 28,72 50,00 736,40
6- Bio-Gel A 32,0 (= 1120/35) 41,50 (= 1120/2700) x 100 820,50 (= 32/0,039)

b) Afin de déterminer quelle étape fut la plus efficace dans la purification de l'enzyme, il s'agit de diviser le degré de purification après une étape x par le degré de purification de l'étape précédente. Ainsi, l'étape de chromatographie sur DEAE a permis la plus grande purification de l'enzyme, soit 36 fois (= 110,5/3;07).
Conclusion sur le protocole de purification suivi dans la purification de l'enzyme E: Ce protocole (constitué de 6 étapes) permet de purifier l'enzyme 820,5 fois en gardant 41,5% de l'enzyme de départ (c.a.d perte de 58,5% de l'enzyme de départ).
c) Considérant que la protéine est pure après tamisage moléculaire, on aura donc recueilli 35 mg de l'enzyme E. Ceci correspond à 41,5 % de la quantité d'enzyme présente initialement dans l'extrait (rendement). Ainsi, dans notre extrait initial, on avait: 35 mg / 41,5% = 75,9 mg
Et cette quantité d'enzyme était initialement présente dans 70000 mg de protéine. On avait doncdans l'extrait brut: (75,9 mg / 70 000 mg) x 100 = 0,108 % de l'enzyme E


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