DNA. Genie genetique

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Gène. Clonage (gene cloning, تنسيل المورث)

Le clonage moléculaire d'un gène (gene cloning, تنسيل المورث) est une étape dans le génie génétique (genetic engineering, هندسة وراثية) et la transgénèse. Il consiste à insérer un fragment d'ADN dans un vecteur approprié.


Clonage d'un gène (gene cloning, تنسيل المورث)

Le clonage moléculaire est une des bases du génie génétique. Il consiste à insérer un fragment d'ADN (dénommé insert) dans un vecteur approprié comme un plasmide par exemple. Le nouveau plasmide ainsi créé sera ensuite introduit dans une cellule hôte, en générale la bactérie Escherichia coli. Celle ci sera alors sélectionnée et multipliée afin d’obtenir une grande quantité du plasmide d’intérêt. Cloner un gène consiste donc à l’insérer dans un plasmide. Un clone sera le transformant bactérien qui contient ce plasmide particulier. Dans ce cas on parle de clone car tous les individus de la colonie bactérienne sont génétiquement identiques.
Le clonage moléculaire est différent du clonage reproductif (créer un individu
génétiquement identique à un autre avec un âge différent) et du clonage thérapeutique (générer des tissus à partir de cellules souches pour réaliser des greffes compatibles avec un receveur).

يعتبر الإستنساخ الجزيئي - Clonage moléculaire, molecular cloning -   أساس علم البيولوجيا الجزيئية و هو من أهم تقنيات الهندسة الوراثية التي تستهدف التطوير والإنتاج

La recombinaison in vitro d'un ADN porteur de gènes qui seront clonés dans des cellules est une des technologies de base du génie génétique. Quatre étapes principales peuvent être distinguées dans la purification d'un gène par génie génétique. Elles concernent les sources de l'ADN à cloner, l'insertion de l'ADN dans un vecteur, le clonage de l'ADN recombiné dans une cellule en culture et l'identification du clone cellulaire ou du virus contenant l' ADN recombinant.

- Sources d'ADN sujet au clonage

1/ ADN obtenu à partir de l'ADN génomique d'une cellule: L'ADN génomique d'une cellule provient d'une digestion par une ou plusieurs enzymes de restriction. Contrairement au cDNA synthétisé à partir du mRNA, l'ADN génomique peut contenir des gènes entiers (exons + introns). Une banque d'ADN (ou bibliothèque) est une collection de clones recombinants renfermant chacun un ADN étranger (insert) particulier.

La coupure de l'ADN par des enzymes de restriction produit des extrémités se recombinant facilement avec d'autres fragments d'ADN comme ceux des ADN vecteurs. A titre d'exemple, l'enzyme de restriction EcoRI coupe le DNA d'une cellule animale en un million de fragments de longueurs différentes (quelques dizaines à plusieurs milliers de paires de bases). Concernant les enzymes de restriction on parle de 'x-cutter' signifiant une enzyme de restriction reconnaissant un site avec x paires de bases.

عملية الحصول على قطعة محددة من جزيء الدن ا التي تكون المورث تتطلب عزل ال د ن أ بشكل نقي و سليم ثم معالجته بالأنزيمات المحددة المناسبة للحصول على القطعة المحددة، بعدها يتم إقحام القطعة ذاخل ناقل معين - vecteur - من قبيل النواقل البلازميدية أو الفيروسية

Pour le clonage d'ADN génomique d'eucaryotes (ADN de grande taille), on ne peut pas utiliser les plasmides comme
vecteur (trop petit insert). On doit choisir des phages ou des cosmides. Aussi, on peut opter pour les enzymes de restriction 4-cutters, car les coupures sont plus fréquentes par rapport aux 6-cutters. Les fragments de faible taille faciles à insérer dans des phages. Les 6-cutters peuvent être utilisées pour des insertions dans des vecteurs BAC ou YAC. On digère l'ADN génomique et on isole les fragments sur gradient de sucrose. Ces fragments sont insérés ensuite dans bactéiophages.

enzymes restriction


Banque ADN génomique

Une banque correctement élaborée, contiendra, sous une forme morcelée, l’ensemble de l’information d’un individu telle qu’elle existe dans son génome (banque génomique).
Une banque d'ADN génomique ne sera représentative que si elle contient, au moins une fois, l’ensemble des séquences du génome. Ainsi, plus les inserts sont longs, plus faible sera le nombre des clones nécessaires. Une formule statistique permettant de déterminer le nombre (N) de clones nécessaires, compte tenu de la longueur des inserts a été établie par Clarke et Carbon. Cette formule est : N = -log ( 1-P )/(1-1/n), avec P = Probabilité de présence d'une séquence donnée et n = (longueur du génome) / (longueur moyenne des fragments insérés). Ainsi le nombre de clones N sera 860 et 320 pour une probabilité de présence = 0,99 avec des longueurs de l'insert de 15 kb et 40 kb, respectivement.

Combien peut-on avoir de fragments d'ADN à cloner lors du séquençage d'un génome de 3*109 bases en utilisant dans la digestion une enzyme 4-cutter qui isole des fragments d'ADN de 15-25 Kb?

Réponse: Grandeur du génome: 3*109 bases, taille du fragment: 1,5*104 bases
d'où nombre de fragments différents: 3*109 bases/1,5*104 bases = 2*105 fragments différents.


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Sciences de la vie. Glossaire


Cas du clonage de l'ADN génomique dans un phage:

1) Digestion: L'ADN phagique et l'ADN genomique sont digérés par la même enzyme de restriction. L'ADN phagique est ouvert au niveau du site de restriction. l'ADN genomique est fragmenté.

2) Traitement: L'ADN phagique ouvert est traité par la phosphatase alcaline de façon à ce qu'il ne puisse se refermer sur lui-meme sans avoir intégre un ADN etranger (fragment d'ADN genomique). La phosphatase alcaline est capable d'hydrolyser les ADN, ARN et nucleotides libres. Elle retire le P en 5' et libère un P inorganique et une extremite 5'OH. Ainsi, elle empêche l'action des ligases sur les acides nucléiques (car elles ont besoin d'une extrémité 5'P libre sur le brin à lié).
3) Ligation: On reuni les deux digestions en présence de T4 DNA Ligase. On obtient un ADN phagique recombinant.
4) Encapsidation.
5) Infection.

6) Sélection sur plage de lyse: Chaque plage correspond à 1 phage recombinant avec un insert particulier. L'ensemble des plages de lyses correspond à la banque d'ADN génomique eucaryote.

banque ADN génomique

7) Criblage: Hybridation de plage de lyse

2/ ADN synthétisé à partir de l'ARN messager (ARNm ou mRNA): un ARNm contenant le polyA ou un mARN purifié peuvent servir de matrice pour la synthèse de ADN par une transcriptase réverse (ADN polymrase ARN dépendante) de virus. Cette synthèse nécessite une amorce (primer) comme oligo dT. L'ADN obtenu ou ADN complémentaire (= ADNc ou cDNA) correspond à une partie du gène. Ainsi, des ADN (ADNc ou cDNA) de 2000 paires de bases ont pu être synthétisés à partir d'ARNm. Le mRNA ne contenant pas d'introns (séquences non codantes), l'ADN lui correspondant par synthèse ne contient que des gènes avec uniquement leurs exons (séquences codantes). Il comporte une information sur les régions 5' et 3' non traduites. Animation, quiz: Formation du cDNA

Comment obtient-on un cDNA?

Etant très sensibles aux ribonucléases qui les détruisent, les ARNm (1-5% de l'ARN total de la cellule) sont difficiles à manipuler. Il devient nécessaire de recopier la séquence en DNA pour augmenter sa stabilité et s'assurer de son amplification en fonction des besoins. Les ARN messagers sont caractérisés par la présence du côté 3’-terminal d’une queue poly(A) synthétisée pendant la phase post-transcriptionnelle. le mRNA est purifié par chromatographie d'affinité sur une colonne d'oligo-d(T)) de quelques dizaines de nucléotides qui peuvent s’hybrider avec les mRNA poly(A). Après un lavage de la colonne en milieu alcalin (KOH), les RNA totaux sont chargés à haute force ionique sur la colonne (KCl 0,5 M). Celle ci est rincée avec du KCl 0,1 M en surveillant l’absorbance de l’éluat à 260 nm pour s’assurer de l’élimination des RNA non retenus par la colonne (rRNA, tRNA,... ). La fraction retenue (mRNA) est éluée de la colonne en abaissant la concentration de KCl à 0,01 M et en élevant la température. Un essai avec la reverse transcriptase permet de s’assurer de la qualité du RNA poly(A) comme matrice pour une meilleure synthèse de cDNA.

Pour le répliquer en cDNA, le mRNA est lié dans un premier temps avec des oligonucléotides poly(T) (rôle d'amorce) qui s'attachent à la queue poly(A) des mRNA. A partir de l'extrémité 3' de cette amorce poly(T) la transcriptase réverse (DNA polymérase RNA dépendante), synthétise un brin de DNA complémentaire du messager de départ.

mRNA purification

Synthèse cDNA (ADNc)

Une fois cette synthèse de DNA est achevée, le RNA est dégradé par une base forte ou une ribonucléase spécifique (RNase H). Le brin de DNA fabriqué forme spontanément à son extrémité 3' une boucle en épingle à cheveux (hairpin) en s'hybridant sur lui-même. L'extrémité 3' de cette boucle servira de site de démarrage pour la DNA polymérase qui va synthétiser un brin de DNA complémentaire du premier. Une nucléase spécifique du DNA simple brin supprimera la boucle de l'extrémité. Le cDNA double brin est prêt. Ainsi, autant de cDNA seront construit avec autant de RNAm présents dans une cellule. l'ensemble de ces cDNA forme une 'banque de cDNA'.

Est-ce que un cDNA correspond exactement au gène ?

Non !! En effet, le cDNA ne donne pas d'information sur les séquences nucléotidiques des introns constituant le gène.

Si le mRNA d'une protéine est peu abondant, comment pourra-t-on préparer un cDNA ?

On préparera le cDNA en se basant sur la séquence en acides aminés de la protéine correspondant au mRNA. Cette séquence d'acides aminés reflétera la séquence des bases des nucléotides des exons du gènes (les introns seront absents).
1. Purification de la protéine par chromatographie
2. Micro-séquençage de la protéine : protéine coupée en plusieurs petits peptides de 5 à 30 acides aminés.
3. Purification des peptides par chromatographie HPLC (High Pressure Liquid Chromatography). Ainsi les peptides seront isolés.
4. Séquençage automatique des peptides par la méthode d'Edman. Exemple de séquences : NQGNLH).
5. Détermination (proposition) de la séquence du cDNA en se référant à la séquence d'acides aminés (selon le code génétique).

Cependant, la séquence exacte du cDNA ne sera pas connue immédiatement, car un acide aminé peut correspondre à plusieurs codons (séquence de 3 bases). Aussi, uniquement 61 parmi 64 codons du code génétique codent pour les 20 acides aminés (dégénérescence du code génétique).
Séquences de bases de nucléotides correspondantes au peptide NQGNQQH :
- L'acide aminé N (Asn, asparagine) correspond aux séquences (2) d'ADN notées TTR, avec R pouvant être G ou A.
- L'acide aminé Q (Gln, glutamine) correspond aux séquences (2) d'ADN notées GTY, avec Y pouvant être C ou T.
- L'acide aminé G (Gly, glycine) correspond aux séquences (4) d'ADN notées CCN, avec N pouvant être G, A, C ou T.
- L'acide aminé L (Leu, leucine) correspond aux séquences (8) d'ADN notées RAN, avec R pouvant être G ou A et N pouvant être G, A, C ou T.
- L'acide aminé H (His, histidine) correspond aux séquences (2) d'ADN notées GTR, avec R pouvant être G ou A.

Séquence NQGNLH :

Acide aminé N Q G N L H
Séquence TTR GTY CCN TTR RAN GTR
Possibilités 2 2 4 2 8 2

3/ ADN de synthèse chimique: le principe consiste à relier des nucléotides d'enchaînement connu en fixant un trinucléotide sur un support comme le sépharose et en ajoutant d'autres trinucléotides présynthétisés. Une fois détachée de son support, la chaîne des désoxyribonucléotides servira de matrice pour synthétiser le brin de ADN complémentaire. Ainsi, des ADN double brins de plus de 50 paires de bases ont pu être synthétisés. La synthèse chimique de ADN à cloner concerne des petits fragments de ADN ('petits gènes')comme ceux des gènes des neuropeptides.

Animation, quiz : constitution du plasmide vecteur (étapes)

- Insertion de l'ADN sujet au clonage dans un vecteur
Le ADN synthétisé chimiquement ou à partir des mRNA ainsi que les fragments de l'ADN génomique doivent être portés par un vecteur capable de se répliquer et d'être transféré dans une cellule. Pour assurer cette recombinaison in vitro, il est nécessaire d'assurer une préparation préalable de l'ADN à cloner et de l'ADN vecteur. La stratégie suivie est leurs coupures par la même enzyme de restriction. Les extrémités collantes des deux ADN se reconnaitront. Elles seront soudées par une ligase. Ainsi, des molécules hybrides (vecteur + ADN à cloner) seront reconstituées. Si cette méthode ne donne pas de résultats satisfaisants, il faudra faire appel à des modifications des extrémités des ADN. Ainsi, des queues oligo dG (20 dG) et d'oligo dC (20 dC) peuvent être ajoutées respecticement à l'ADN vecteur et à l'ADN à inserer. Par appariement des deux séquences, le ADN à cloner sera inséré dans le ADN vecteur. Une autre stratégie valable pour le ADN génomique consiste à attacher à l'ADN à insérer un décamère synthétique (linker) avec digestion par des enzymes de restriction correspondant au site de coupure du ADN vecteur.

Clonage de l'ADN recombiné dans une cellule en culture
L'ADN hybride recombiné et l'ADN non recombiné résultant de l'étape du clonage dans un vecteur, seront introduits 1) soit dans des bactéries par transfert (plasmide) ou par infection (bactériophage), 2) soit dans une cellule eucaryote en culture par transfection ou par infection avec un virus à ADN.
Le plasmide recombinant transféré dans les bactéries s'autorépliquera facilement. Les colonies bactériennes le contenant peuvent être isolées. Quant au bactériophage recombinant, il se reproduit en lysant les bactéries. On isolera des plages de lyse. L'ADN recombiné peut être cloné dans une cellule en culture. La fusion cellulaire et la précipitation des cellules avec l'ADN (par utilisation du phosphate de calcium) permettent la transfection de l'ADN recombinant. On obtient des cellules transformées.

Animation, quiz: clonage d'un gène (différentes étapes)

Identification du clone cellulaire ou du virus contenant l'ADN recombinant
L'identification du clone cellulaire exige l'utilisation de marqueurs de sélection ou de procédés d'hybridation adaptés.
Les marqueurs de sélection sont associés au vecteur ou au fragment de ADN à détecter.Ainsi, la résistance aux antibiotiques liée aux gènes portés par les plasmides bactériens est un marqueur de la présence d'un plasmide recombinant.
L'hybridation du ADN recombinant avec un fragment de ADN ou de ARN comlémentaire permet d'identifier le clone désiré dans un mélange hétérogène. Le ADN des clones bactériens est hybridé in situ avec le ADN sonde marqué radioactivement.

ALLER A: ADN. Expression des gènes


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