Protéines (بروتينات). Séquences d'acides aminés

La détermination des séquences d'acides aminés d'une protéines (بروتينات) ou d'un peptide (séquençage) est approché par des attaques enzymatiques dans des endroits précis de la molécule.


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Vocabulaire:

- Acide aminé (Fr) = Amino acid (Eng) =حمض أميني (Ar).
- protéine (Fr) = Protein (Eng) = بروتين (Ar)
- Séquence (Fr) = Sequence (Eng) = متتالية (Ar)

Proeines. Séquences, séquençage


Faire les Exercices d'abord et regarder ensuite les réponses, à la fin de cette page..


QUESTION 1 (Réponse 1). L'hydrolyse totale (HCl 6N, 110°, 24 H) d'un peptide P suivie d'une analyse d'acides aminés montre une composition de 20 acides aminés:

Ala2, Arg, Cys2, Glu, Gly2, Leu2, Lys, Phe2, Pro, Thr, Tyr2, Val3

- La chymotrypsine donne 2 acides aminés séparés, Phe et Tyr et 3 peptides A, B et C dont le séquençage par par la méthode d'Edman donne:
A = Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe
B = Val-Cys-Ala-Leu-Tyr
C = Thr-Pro-Lys-Ala

- Un nouvel échantillon du peptide initial est soumis au clivage par la trypsine. Il en résulte une Ala et 2 fragments, D et E qui donnent après séquençage par la méhode d'Edman:
D = Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
E = Val-Cys-Ala-Leu-Tyr-Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg

Déterminer la séquence complète du peptide P


QUESTION 2 (Réponse 2). Le peptide P0 est constitué de 6 acides aminés différents dont un acide aminé précurseur de la sérotonine et un autre sans pouvoir rotatoire. Le bromure de cyanogène coupe P0 en libérant un fragment P1 de deux acides aminés du côté N-terminal et d'un fragment P2 de 4 acides aminés contenant un acide aminé hétérocyclique, comme révélé par le réactif d'Edman. Il a été montré que P1 et P2 sont susceptibles d'être coupés par la trypsine. Parmi les séquences suivantes, choisir celle(s) qui correspond(ent) au peptide P0:

a) LYS-MET-PRO-TRP-ARG-GLY.
b) ARG-MET-PRO-ARG-GLY-TRP.
c) HIS-MET-PRO-ARG-GLY-PHE.
d) LYS-MET-PRO-ARG-GLY-PHE.
e) ARG-MET-PRO-GLY-HIS-PHE.


QUESTION 3 (Réponse 3). Réduit avec le béta-mercaptoethanol, un polypeptide donne deux fragments peptidiques (chaînes):

chaîne 1: A-C-F-P-R-K-W-C-R-R-V-C et chaîne 2: C-Y-C-F-C.

Digéré avec la thermolysine, le polypeptide sous sa forme non-réduite donne les fragments suivants:
(A,C,C,V), (R,K,F,P), (R,R,C,C,W,Y) et (C,C,F)

Indiquez la position des ponts disulfure dans ce polypeptide.


QUESTION 4 (Réponse 4). On procède au séquençage d'un polypeptide P. On obtient les résultats suivants:

a) hydrolyse acide: (Ala4 , Val, Lys2 , Arg, Gly, Asp, Met, Pro, Trp)
b) digestion à la carboxypeptidase: Lys
c) traitement au dinitrofluorobenzène: Val
d) traitement au bromure de cyanogène: génération de deux peptides:
peptide A: (Gly, Arg, Trp, Asp, Lys, Ala) et peptide B: (Ala3 , Lys, Val, Met, Pro)

- Le traitement du peptide A au DNBF et carboxypeptidase donne:
DNFB: Gly Carboxypeptidase: Lys

- Le traitement du peptide B au DNFB et carboxypeptidase donne:
DNFB: Val Carboxypeptidase: Met

e) digestion à la trypsine: génère trois peptides:
peptide C: (Lys, Trp, Ala), peptide D: (Ala3 , Val, Lys, Pro) et peptide E: (Met, Asp, Gly, Arg)
- Le traitement du peptide C au DNFB et carboxypeptidase donne: DNFB: Trp

- Le traitement du peptide E au DNFB et carboxypeptidase donne: DNFB: Met
- Le traitement du peptide D avec la thermolysine donne : Val, Ala, Ala, (Ala, Lys, Pro)

Quelle est la structure primaire de ce peptide?



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Protéines, E,zymes


 


Réponses

Réponse 1 (Question 1)

La chymotrypsine ne coupe pas à droite de Ala: le fragment C est donc la séquence terminale. La carboxypeptidase confirme que Ala est bien l’acide C terminal

      17 18 19 20
Chymotrypsine 1 ? ? ? ? ? .. Thr Pro Lys Ala
Chymotrypsine    
Fragment C
 

L'hydrolyse par la trypsine donne le fragment D se terminant par Lys, il s'agit de Lys19 et la comparaison des séquences de C et D permet de mieux préciser l'extrémité du peptide.

La reconstitution de la séquence complète est facilement réalisée en partant du peptide porteur du C terminal et en cherchant les recouvrements des fragments.

Chymotrypsine Val- Cys- Ala- Leu- Tyr                              
Trypsine Val- Cys- Ala- Leu- Tyr- Val- Leu- Val- Cys- Gly- Glu- Arg-                
Chymotrypsine           Val- Leu- Val- Cys- Gly- Glu- Arg- Gly- Phe            
Chymotrypsine                             Phe          
Chymotrypsine                               Tyr        
Trypsine                         Gly- Phe -Phe -Tyr -Thr -Pro -Lys  
Trypsine                                       Ala
Chymotrypsine                                 -Thr -Pro -Lys Ala

La séquence totale du peptide P est:

Val-Cys-Ala-Leu-Tyr-Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala


Réponse 2 (Question 2)

- Le seul acide aminé sans pouvoir rotatoire : la glycine
- Le seul acide aminé précurseur de la sérotonine : le tryptophane.

- La réaction au BrCN indique qu'il y a une méthionine (Met) en 2ème position, car il y a une coupure de la liaison peptidique (côté COOH). Il n'est pas en dernière position car il n'y a pas de transformation en homosérine (Hse).

Rappel: Le bromure de cyanogène (BrCN) coupe le côté COOH d'une méthionine (Met). Si la méthionine est en dernière position, elle sera transformée en homosérine (Hse)

- La réaction avec le réactif d'Edman indique que le 1er acide aminé du fragment P2 ou le 3ème du peptide P0 (côté NH2) est un acide aminé hétérocyclique. Le seul acide aminé hétérocyclique est la proline (histidine et tryptophane en moidre degré).

Rappel: Le réactif d'Edman permet de séquencer jusqu'à 50 Acides aminés. Il permet de révéler les acides aminés du côté NH2.

- La réaction avec la trypsine nous apprend qu'il y a un acide aminé basique (Arg ou Lys) en 1ère position du peptide P0 et un autre qui peut être en 4ème ou en 5ème position de P0 (car il y a une coupure du côté COOH). Attention, il n'est pas exclu qu'il y ait un 3ème acide aminé basique en 6ème position de P0, mais on ne dispose pas d'informations nécessaires pour le déterminer.

Rappel: La trypsine, endopeptidase, coupe un acide aminé basique (Lysine ou Arginine) du côté COOH. Elle ne coupe pas
après une histidine.

Résumé: 1 NH2 2 3 4 5 6 COOH
Arg, Lys Met Pro ? ? ?

-Pour les 3 derniers Acides aminés restant, il y a un acide aminé basique (Arg ou Lys) en 4ème ou 5ème position de P0, une glycine et un tryptophane.
- De plus, les 6 acides aminés de la séquence doivent être tous différents.
- Avec ces informations, nous pouvons être sûr qu'il n'y a pas d'acide aminé basique en dernière position
- La séquence ARG-MET-PRO-GLY-HIS-PHE (e) est à éliminer, car il manque un tryptophane. Aussi, la trypsine ne peut pas couper après une histidine, bien qu'il soit un acide aminé basique.
- La séquence ARG-MET-PRO-ARG-GLY-TRP (b) est à écarter, car il faut 6 acides aminés différents, or cette séquence montre 2 arginines.
- La séquence LYS-MET-PRO-ARG-GLY-PHE (d) est Impossible car il n'y a pas de tryptophane et la trypsine ne peut pas couper après une histidine.
- La séquence HIS-MET-PRO-ARG-GLY-PHE (c) est à éliminer.En effet, elle ne contient pas de typtophane
- La séquence LYS-MET-PRO-TRP-ARG-GLY (a). Possible car cette proposition respecte tous les critères énoncés.
Donc ici, seule la réponse a) est à retenir.

acides aminés. Séquence


Réponse 3 (Question 3). La thermolysine coupe le lien peptidique du côté N-terminal de résidus hydrophobes. La digestion des deux fragments du peptide suite à la réduction des ponts S-S nous donne:

chaîne 1: A-C, F-P-R-K, W-C-R-R, V-C
chaîne 2: C, Y-C F-C.

Comme les liens disulfures du peptide sont intacts lors de la digestion à la thermolysine, certains des fragments décrits ci-dessus seront liés via des ponts S-S impliquant des Cys. Selon les fragments de digestion alors obtenus, on peut déduire la position des ponts S-S comme étant:

ponts dissulfures Remarque: Peuvent exister à la fois dans une molécules des ponts S-S- intrachaîne et interchaînes.

Réponse 3 (Question 4)

La digestion du peptide P par la carboxypeptidase indique que l'acide aminé C-terminal est Lys.
Le traitement de P au DNFB montre que l'acide aminé N-terminal est Val.
La digestionde P par la trypsine permet d'ordonner partiellement les peptides obtenus comme suit:

peptide C: Try-Ala-Lys peptide D: Val-(Ala, Ala, Ala, Pro)-Lys (Val est Nterminal)
peptide E: Met-(Asp, Gly)-Arg

Le peptide E peut être ordonné grâce aux résultats du traitement au CNBr: Met-Gly-Asp-Arg
Le traitement avec la thermolysine permet d’ordonner les Ala par rapport à Pro : Val-Ala-Ala-Ala-Pro-Lys

La séquence du peptide est finalement: Val-Ala-Ala-Ala-Pro-Lys-Met-Gly-Asp-Arg-Try-Ala-Lys

 


Protéines. Séquences, séquençage