ELECTROPHORESE. ASPECT THEORIQUE ....EXERCICES , QCM...SUPPORTS PEDAGOGIQUES....

L'électrophorèse est une technique d'analyse et de séparation basée sur les critères de la charge électrique et la taille des molécules. La migration différentielle de particules chargées électriquement, se fait sous l'influence d'un champs électrique. Seules les particules chargéespositivement ou négativement sont attirées par les pôles opposés du champs électrique. Les composés qui peuvent être transformés en particules chargées par formation de complexes, sont de même sujets à une migration sous l'effet du champs électrique. Parmi les supports utilisés dans la technique d'électrophorèse, on note le gel de polyacrylamide donnant de bonnes résolutions lors de la séparation.

Le pH des solutions joue un rôle très important dans l'acquisition des charges électriques. Ainsi,dans le cas des protéines, le Ph auquel la charge électrique globale est nulle est appelé point isoélectrique.

PRINCIPE

Une protéine en solution portée à un pH inférieur à son PI, se comporte comme une base et  capte des protons H+. Elle devient chargée positivement.- Une protéine mise à un pH supérieur à son PI (point isoélectrique), se comporte comme un acide et cède des  protons . Elle sera chargée négativement. Prenons le cas d'un acide aminé A. Ses charges seront:

.........Milieu acide         Milieu basique

A+       <-----      A+       ---->   A-

Sous l'action d'un champs électrique, E, une protéine se déplace avec une vitesse, v, proportionnelle au champs :v = µE, avec µ  appelée 'mobilité électrophorétique' µ= v / E   (1)  avec : µ en cm2.s-1.volt-1, v en cm.s-1 et E en volt.cm-1
Le champs électrique (E) crée entre 2 électrodes, exerce une force, F, sur une protéine que l'on suppose sphérique et de charge q;
F = q E

Les forces de frottement, F', dues à la viscosité (eta) vont s'opposer à la migration de la protéine et la freiner;
F' = 6 (pi) (eta) v r, avec : v : vitesse de la protéine, r : rayon de la protéine et (eta): coefficient deviscosité

E ---------->

F'  <-------O------->  F    

------> sens de déplacement

Lorsque les 2 forces s'équilibrent (déplacement avec une vitesse constante);
F = F'q E  =  6 (pi) (eta) v r
donc :     v = (q E) / (6 (pi) (eta) v r)            (2)
(2) dans (1) :      µ= q / 6 (pi) (eta) r

Donc, la mobilité d'une particule migrant dans un champs uniforme dépend de 3 facteurs : q, (eta) et r.

*Elle est proportionnelle à sa charge (q).*Elle est inversement proportionnelle au coefficient de viscosité du milieu , (eta)

*Elle est inversement proportionnelle à son rayon (r).

SUPPORTS DE MIGRATION UTILISES EN ELECTROPHORESE.
Les supports utilisés en électrophorèse sont nombreux, avec des degrés de résolution variables. Leurs types ont permis de distinguer plusieurs appellations en électrophorèse, comme : - électrophorèse en veine liquide- électrophorèse sur papier- électrophorèse sur gels (agarose, amidon, polyacrylamide...).

GELS DE POLYACRYLAMIDE
L'éléctrophorèse sur gel de polyacrylamide est est actuellement une technique très utilisée dans les laboratoires de recherche. Avertissement : avant sa polymérisation le polyacrylamide est neurotoxique.

Comment ils sont formés les gels de polyacrylamide ?
Le réseau de polyacrylamide est formé par polymérisation de monomère d'acrylamide (Acryl) en présence du bis acrylamide (NN'méthylène-bisacrylamide).

Le bis acrylamide est l'équivalent de 2 monomères d'acrylamide liés par un groupement méthyl. Il et est utilisé comme agent pontant. Après réaction de polymérisation on obtient un gel de polyacrylamide avec un degré de réticulation bien précis (dépendant du pourcentage du bis acrylamide).
Le e pourcentage C de Bis par rapport à l''acrylamide est: C = [poids (Bis)/ poids(acrylamide+Bis)]x 100. L'acrylamide se polymérise en longue chaîne. De temps en temps une molécule de bis acrylamide est incorporée dans le polymère. La polymérisation de l'acrylamide est un exemple de catalyse par radicaux libres initiée par l'addition de persulfate d'ammonium et de TEMED (NNN'N'-tétraméthyléthylènediamine).

Le TEMED catalyse la décomposition des ions persulfates pour donner un
radical libre R· (molécule avec un électron seul).
La polymérisation du polyacrylamide (A) se fait selon les réactions
suivantes:

électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
Ce type d'électrophorèse peut être réalisé en utilisant des systèmes tampons dissociant ou non dissociant, continus ou non continus. L'agent dissociant le plus utilisé est le détergent anionique; Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Une fois fixé sur les protéines (à chaud) le SDS affecte une charge négative (-) à tous les polypeptides. Ces derniers migreront, donc, dans le gel de polyacrylamide selon leur taille, uniquement. Ainsi, l'experimentateur peut déterminer le poids moléculaire (PM) des différents polypeptides en se référant à la mobilité de polypeptides de PM connus (marqueurs de PM).

Le système tampon non dissociant est recommandé pour l'électrophorèse de protéines natives, où l'interaction subunitaire, la conformation et l'activité biologique des protéines doivent être préservées. Dans ce cas, la séparation se fait sur la base de la charge et de la taille.Les systèmes tampons discontinus (multiphasiques) utilisent différents tampons à des Ph différents.

Exemple de systèmes tampon discontinus : le système d'Ornstein.
L'utilisation de tampons discontinus dans leur pH et la nature des ions, permet la concentration préalable de l'échantillon à séparer. Les gels de polyacrylamide répondant à cette condition, présentent 2 types de structures:
- Un gel de concentration (stacking gel).- Un gel de séparation (resolving gel).
L'utilisation en électrophorèse de gels de concentration et de séparation de concentrations en polyacrylamide non convenable peut aboutir à 2 situations différentes :
- Elimination des protéines incapables de pénétrer dans le gel, dans le cas des gels très concentrés.- Absence de séparation des protéines de petite taille, migrant avec le front.Entre ces 2 extrêmes, les protéines peuvent être résolues différemment selon la concentration en polyacrylamide du gel  de séparation:

Extraction et Révélation des isoenzymes (vidéo)

(Polyacrylamide) (%)     Poids moléculaire (Kd)

15-20-------------------------------10-40
10-15 ------------------------------40-100
5-10 --------------------------------100-300
5 ------------------------------------300-500
2-5 --------------------------------PM>500

REVELATION DES PROTEINES ET DES ACIDES NUCLEIQUES SEPARES PAR ELECTROPHORESE

REVELATION IN SITU SUR GEL

Lorsqu'il s'agit des protéines, celles ci sont généralement incolores. Leur visualisation sur les supports d'électrophorèse s'effectue par des procédés histochimiques qui permettent soit de colorer les produits de dénaturation de la protéine ou une partie chimique qui lui est associée, soit d'obtenir un précipité coloré à l'emplacement de cette protéine en utilisant ses propriétés catalytiques ou antigéniques (voir cours).
Des exemples de gels révélés au laboratoire pour la détection du polymorphisme des systèmes enzymatiques (activité biologique) et la mise en évidence de la variabilité du DNA sont expliqués.

REVELATION DES PRODUITS SEPARES SUR GEL APRES LEUR TRANSFERT SUR MEMMBRANE. WEWTERN ET NORTHRN BLOTTING
La révélation in situ sur gel des protéines par réaction antigène-anticorps est coûteuse, car les protéines séparées restent " emprisonnées " dans le gel. Pour diminuer les quantités les coûts d'anticorps à ajouter pour révéler les protéines, il faut éluer les protéines du gel. Les différentes protéines contenues dans le gel seront adsorbées sur un nouveau support (exemple: membrane de nitrocellulose). La formation de l'empreinte se dit blot en anglais d'où le nom western blot, western n'étant qu'un jeu de mot en rapport avec la technique initiale du Southern blot se faisant avec de l'ADN (technique inventée par Mr. Southern).

L'mmunodétection (immunomarquage) est une des meilleures méthodes pour caractériser une protéine au milieu d'autres protéines. La protéine (antigène) réagit avec les anticorps spécifiques (anticorps primaires). Une fois le complexe antigène-anticorps formé. Il est détecté grâce à un deuxième anticorps (anticorps secondaire) qui détecte les emplacements où les anticorps primaires se sont fixés sur des antigènes collés à la membrane. L'anticorps secondaire anti-IgG de lapin est lié (ou conjugué) de manière covalente à une peroxydase (POX) (comme l'enzyme HorseRadish Peroxidase, HRP). l'activité enzymatique est détectée grâce à une méthode de chimiluminescence améliorée pour trouver la position des complexes antigène-anticorps.

Animations: Transfert du dna. Southern Blotting
'Southern Blotting', développée par Edwin Southern, est une techniques permettant d'identifier le DNA ayant une séquence nucléotidique précise.

Effet de la composition ionique des tampons sur la séparation électrophorétique.
1/ Les tampons à faible force ionique entraînent a/ une migration rapide (donc diffusion faible), b/ un chauffage faible, c/ bandes moins résolues.
2/ Les tampons à force ionique élevée entraînent a/ une migration faible (donc diffusion élevée), b/ un chauffage élevé, c/ bandes plus résolues.
Les systèmes tampons sont choisis de façon à avoir une force ionique du tampon du gel inférieureà celle du tampon d'électrodes.
Les systèmes tampons sont choisis de façon à avoir une force ionique du tampon du gel inférieure à celle du tampon d'électrodes.
Les PI de la plupart des protéines se situent entre pH 4,0 et 7,0. Donc, les tampons à pH compris entre 8 et 9,5 sont souvent utilisés lors de l'électrophorèse des protéines.
Effet du mode de séparation ''voltage (V) constant' ou 'Intensité (I) constante':
Séparation à V constant: Si R augmente, I diminuera (car V = Rx I). Ceci entraîne dinimution du chauffage (lié à la puissance (P); P = I x I x R).
Séparation àI constante: la mobilité reste constante. Si R augmente, le chauffage augmentera (P augmente)