Biochimie, biotechnologies

ADN purifié. Analyse par électrophorèse
عزل الحمض النووي الريبوزي ناقص الأكسيجين بواسطة الكهرتهجير
Vidéo du Travail pratique
Purification et Electrophorèse de l'ADN
L'extraction et purification de l'acide désoxyribonucléique (ADN, DNA, الحمض النووي الريبوزي ناقص الأكسيجين) est une étape importante dans l'étude de cette molécule porteuse de l'information génétique

Après avoir procédé à l'extraction et la purification de l'ADN des plantes (Première partie du TP S5), (Pour rappel, la purification de l'ADN et sa quantification ont fait l'objet de TP précédents; en S3). Il y'a lieu de passer à son analyse par électrophorèse sur gel d'agarose. Les résultats des traitements de l'ADN (hydrolyse par enzyme de restriction, amplification par PCR) sont tributaire du degré de pureté de l'ADN et de son état intact ou altéré au cours des différentes étapes de la purification.


Eléctrophorèse de l'ADN. Introduction

L'électrophorèse reste l'outil le plus important dans l'analyse qualitative (voir même quantitative) des acides nucléiques (ADN, ARN). Son principe doit être bien compris. Les critères de séparation utilisés sont la taille (poids moléculaire) et l'ionicité (charge électrique). Comme les acides nucléiques sont chargés négativement (grâce au phosphate), le critère de la charge électrique n'est pas comptabilisé dans la séparation (toutes les molécules migrent dans la même direction, +) et les fragments de l'ADN sont séparés uniquement en fonction du poids moléculaire. L'analyse des acides nucléiques (en particulier l'ADN) par électrophorèse consiste d'abord à lui faire subir un traitement préalable dont 1/ coupure (restriction) par une ou plusieurs enzymes de restriction (technique RFLP) ou 2/ amplification de certains fragments (ou régions) par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR, polymerisation chain reaction). En plus des critères de l'ionicité et de la taille, la forme des molécules intervient dans le cas des plasmides (voir ci dessous). De ce fait, l'implication de la forme des plasmides dans l'électrophorèse complique la détermination exacte de leurs tailles.
La complexité d'un génome et sa grande taille rendent impossible l'analyse directe des profils de restriction de l'ADN des eucaryotes. Ceci est dû au nombre élevé des fragments de restriction obtenus après action d'une enzyme de restriction (supérieur à 1000000). Dans la majorité des cas, le profil de restriction obtenu après révélation (ou coloration) de l'ADN montre un voile (ou continuum, smear) représentant tous les fragments de restriction tassés sur le gel (tailles faibles vers +) et difficiles à distinguer. Ce problème est résolu par recours à des techniques supplémentaires qui permettent de mettre en évidence uniquement les fragments interessant l'expérimentateur. Ceci est rendu possible par l'utilisation d'une sonde (probe, مجس) marquée préparée pour réagir spécifiquement (par hybridation) avec des séquences précises à travers la technique de transfert (southern blotting). Pour réaliser cette tâche, il faut effectuer un transfert des bandes d'ADN du gel sur une membrane de nitrocellulose (ou nylon). Une reconstitution d'un film, de l'extraction de l'ADN à son analyse, existe sur CD.

L'éléctrophorèse peut être réalisée horizontalement ou verticalement (avec les gels de polyacrylamide).

Electrophorèse des plasmides. Effet de la forme d'ADN

Les plasmides comme pBr 322, existent sous 3 formes dont l'une peut résulter de l'autre suite à des altérations ou une longue conservations:
- Forme superenroulée montrée par le plasmide bien conservé (supercoiled form, en Anglais).
- Forme relachée ou forme circulaire ouverte (Open circular, nicked circle, en Anglais) se rencontrant lors d'une mauvaise conservation du plasmide et portant une coupure sur un seul brin.
- Forme linéaire (Linear form, en Anglais), pouvant résulter de la digestion du plasmide par les enzymes de restriction. Elle correspond à une coupure sur les deux brins.
Par électrophorèse sur gel d'agarose, on peut révéler les formes superenroulées et relâchées en même temps (voir schéma). La conformation de l'ADN affecte la migration électrophorétique. Pour supprimer cet effet de la forme, le poids moléculaire est déterminé sur la base de l'ADN linéaire (résultant de la restriction ou de l'amplification par PCR). Le schéma ci dessous montré le résultat d'une digestion progressive d'un plasmide comme révélé par électrophorèse.


formes du plasmide

Préparation des échantillons pour leur séparation par électrophorèse

Tous les échantillons devant êtranalysés, doivent être mélangés à un Tampon de charge (loading buffer, منظم التحميل) qui les rends visibles (bleu de couleur)et denses (contenant glycérol):
Tampon d'échantillons (T. charge)


- tampon TBE (pH 8,3)
- Xylène cyanol 0,02% -> migre en prallèle avec ADN bicaténaire de 4000 pb sur les gels d'agarose 1%.
- Bleu de bromophénol 0,02% --> migre en prallèle avec ADN bicaténaire de 500 pb sur les gels d'agarose 1%.
- Orange G --> migre en prallèle avec ADN bicaténaire de 50 pb sur les gels d'agarose 1%.
- Glycérol 3% --> augmente la densité des échantillons d'ADN.
Les 3 colorants (voir formules ci dessous) permettent de suivre la migration des fragments d'ADN.

Colour markers

En plus des échantillons d'ADN purifié, Les dépôts concernent aussi:
- Marqueurs des poids moléculaires (pb) correspondant à 1 Kb DNA ladder (10 fragments)VOIR L'ELECTROPHOREGRAMME DES MARQUEURS DE PM
- Dilutions successives (préparées dans le tampons de charge, pH 8,3) de 4 préparations d'ADN de plantes préalablement purifiés (A, B, C et D).
- Plasmide pL9 natif (plasmide recombiné)
- Plasmide pL9 hydrolysé par Hind III (10-100 ng)
- ADN des plantes (A,B, C et D) hydrolysé par Hind III en présence et en absence de la RNase.


Les plasmides recombinés sont utiles dans les opérations du génie génétique et des biotechnologies modernes.


plasmide
Le plasmide pL9 natif montre après électrophorèse 3 bandes correspondant à 3 formes: Forme relâchée (5000 pb), forme linéaire (4000 pb) et forme superenroulée (3000 pb).

De ce fait, avant de démarrer l'électrophorèse, il faut adopter un schéma de dépôt, comme l'exemple ci dessous.

Dépôts. Schéma
Gel d'agarose. Support couramment utilisé en électrophorèse de l'ADN. Quelle concentration choisir?

Le support de migration le plus utilisé dans l'éléctrophorèse de l'ADN est constitué de l'agarose (0,5-2,5%, environ) suivi des gels de polyacrylamides. Les étudiants déposenet de faibles volume d'ADN hydrolysé par une enzyme de restriction comme Hind III.
Un support de migration constitué d'un gel d'agarose à 0,8% qui permet de séparer des frangment de tailles comprise entre 800 et 10000 pb, environ (QCM sur choix du gel?).


gel d'agarose

- Peser l'agarose (polymère à base d'agar purifié) dans un erlenmeyer, en fonction du pourcentage choisi et du volume de gel à préparer.
- Placer l'erlenmeyer contenant la solution d'agarose dans un bain Marie bouillant pendant au moins 20 minutes en agitant de temps en temps.
- Lorsque l'agarose est bien fondue (solution limpide), retirer l'erlenmeyer et laisser refroidir jusqu'à 60°C, environ (voir la vidéo ci dessus, laboratoire BBP, FSSM, Marrakech, Morocco).



- Remarque: si on opte pour la révélation de l'ADN par le Bromure d'éthidium (BET), il sera possible d'ajouter dans la solution d'agarose un volume précis du BET pour avoir une concentration finale de 0.5 µg/ml. Autrement le BET est ajouté en solution après l'électrophorèse.

- Couler le gel d'agarose dans le moule préalablement préparé. Eliminer les bulles. Placer les peignes (servant pour ménager des puits dans le gel) vers une extrêmité du gel et laisser refroidir au moins 45 minutes.


Dépôt des échantillons
Dépôts extraits sur gel d'agarose

Qualité du dépôt :1) pas de bulles, 2)échantillon totalement contenu dans le puits, 3)pas de débordements, 4)pas de puits percé.

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Lancement de l'électrophorèse:

- Avant de lancer l'électrophorèse, enlever les cales et les peignes délicatement pour ne pas altérer les puits.


- Placer le support (avec le gel) dans la cuve d'électrophorèse. Les puits doivent être du côté de la cathode (-, fil noir), car l'ADN est chargé négativement et migrera vers l'anode (+, fil rouge).
- Remplir la cuve avec du tampon TBE 1X (Tris-borate 89 mM (pH 8,3), acide borique 89 mM, EDTA 2 mM) en recouvrant l'ensemble du gel (les puits noyés et resté sous le tamon par 2-3 mm.
- Les extraits d'ADN préalablement mélangés avec le tapon d'échantillon (tampon de charge, loading buffer, منظم التحميل), sont délicatement chargés dans les puits du gel.
Se positionner en haut du puits et déverser le contenu du cône de la pipette doucement sans aller au 2ème puits, retirer la micropipette. Attention à ne pas percer le gel.
Lancement de l'éléctrophorèse

Réglage du voltage: La séparation se fait à voltage constant à raison de 100 volt pendant environ 2 heures de migration (l'intensité en mA reste variable). Normalement, un champ électrique de 5 V/cm est appliqué au gel. La distance entre les électrodes permet de calculer le voltage à appliquer aux bornes du générateur.
Par exemple : si la distance entre les électrodes fait 12 cm, le voltage à régler est de 5 x 12, soit 60 V.
- Un champs plus important accélère proportionnellement la migration, limite la diffusion, mais fait chauffer le gel par effet Joules.
- Si on veut accélérer la migration, il faut augmenter le voltage, mais baisser la force ionique du tampon pour diminuer l'effet Joules (voir QCM électrophorèse).
Rappel des relations liant le voltage, la force ionique et l'effet Joules :
- La relation entre le courant I, la tension V et la résistance R est exprimée comme dans la loi d’Ohm : V=R.I
L’augmentation de la tension V et l’augmentation correspondante du courant I provoqueront l’un des principaux problèmes posés dans l’électrophorèse, en l’occurrence la génération de chaleur (chauffage). Ceci peut être illustré par l’équation suivante où la puissance du courant P (mesuré en watts) généré durant l’électrophorèse est égal au produit de la résistance multiplié par le carré du courant : P = V.I=RI²(correspond au chauffage).

- rho = 1 / R = K.Fi : la conductance (rho) est proportionnelle à la force ionique (Fi) et inversement proportionnelle à la la résistance.
- A voltage constant: si l'on baisse la force ionique, la conductance diminue, donc la résistance augmente, I diminue (car I = V/R) et aussi P diminue (car P =VI): donc chauffage diminue
Conclusion : à voltage constant, diluer le tampon permet de diminuer l'échauffement du gel. On peut donc se permettre d'augmenter la vitesse de migration, en augmentant le voltage à condition de diminuer la force ionique du tampon (par exemple passer du tampon TBE 1 X à 0,5X).
Remarque: Le tampon TAE (Tris-Acétate-EDTA, pH 8,0), de conductivité élvée, génère plus de chauffage que les tampons de faible force ionique comme TBE.


Révélation de l'ADN par le Bromure d'éthidium (BET)

La révélation de l'ADN sur le gel d'agarose est réalisée par le bromure d'éthidum qui est ajouté dans le gel d'agarose à l'état liquide (avant qu'il soit solide) ou simplement en solution dans laquelle on fait incuber le gel pendant 20 minutes, environ, une fois l'éléctrophorèse est terminée. La concentration finale du BET de 0.5 µg/ml. Les fragments d'ADN sont rendus visibles par exposition du gel aux rayons UV à l'obscurité. Lorsqu'il est ajouté dans le gel, il peut causer un ralentissement de la migration d'environ 15%.
Le bromure d'éthidium se lie à l'ADN bicaténaire par intercalation (= agent intercalent).


bromure éthidium

Les rayons UV sont dangereux pour les yeux : il faut porter des lunettes, ou disposer d'une enceinte dans laquelle sont placés le transilluminateur et une caméra.


Interprétation des résultats
Exemple d'électrophoregramme trouvé après séparations des échantillons d'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%..
ADN-plasmide

Pour déterminer le poids moléculaires des fragment d'ADN séparés sur le gel d'agarose, les étudiants tracent la courbe du logarithme des poids moléculaires de fragments d'ADN de poids connus (marqueurs de PM, DNA-ladder) en fonction de la distance parcourue (ou aussi la mobilité relaive) par les différents fragments. La droite : log (taille) = f (distance de migration) permet de déterminer la taille en paires de base d'un fragment d'ADN inconnu.---> VOIR L'ELECTROPHOREGRAMME DES MARQUEURS DE PM


Courbe du poids moléculaire

Télécharger papier semi-log

Estimation de la quantité d'ADN contenu dans les extraits d'ADN des plantes.

Comme exemple, prenons le profil électrophorétique du plasmide hydrolysé avec Hind III et dont la quantité déposée est 60 ng (profil 26 de l'électrophorégramme). Le profil montre deux bandes correspondant à l'insert (voir structure du plasmide) de petite taille (environ 1000 pb, d'après la courbe des PM) et le vecteur de grande taille migrant moins vite par rapport à l'insert et présente environ 3000 pb, comme taille (d'après la courbe log (PM) = f(distance parcourue)). La taille totale du plasmide sera donc 1000 + 3000 = 4000 pb. Elle correspond à 60 ng. Donc, l'insert (1000 pb) correspond à 15 ng et le vecteur correspond à 45 ng. Si l'estimation de l'intensité de l'ADN dilué par exemple 5 fois, est proche de l'intensité de la bande du vecteur (45 ng)on pourra déduire que la quantité d'ADN dans 10 µl de l'extrait d'ADN dilué déposé est également 45 ng. Comme l'extrait de départ a été dilué 5 fois, la quantité d'ADN sera donc (45 x 5) g. Si cette quantité était dans une prise d'essai de 8 microlitres d'ADN , la quantité d'ADN dans 50 microlitres sera 45 x 5 x 50/8 = 1406,25 ng.


Hydrolyse de l'ADN purifié par l'enzyme de restriction HindIII. Exemple d'électrophorégramme à interpréter:

HindIII est une enzyme de restriction isolée de Haemophilus influenzae. En présence de Mg++, elle clive l'ADN au niveau de la séquence AAGCTT.

5'-A |A G C T T-3'

3'-T T C G A| A-5' .


QUESTION. L'ADN de plantes purifié suivant un protocole précis a été soumis à une hydrolyse par HindIII en présence ou en absence de la RNase puis séparé par éléctrophorèse sur gel d'agarose 0,8%. Sur l'électrophorégramme suivant, où se trouve l'ARN? - cocher la réponse juste -

électrophorégramme
a) Bande intense en haut du gel pour les extraits d'ADN hydrolysés par RNase
b) Bande intense et diffuse en bas du gel pour les extraits d'ADN non hydrolysés par RNase
c) Bande intense en haut du gel pour les extraits d'ADN non hydrolysés par RNase


Vidéos du laboratoire (extraits)
. (ces vidéos existent aussi sous DVD avec les livres de l'auteur)

Electrophorèse de l'ADN (DNA) sur gel d'agarose (Préparation des échantillons, dépôt, migration et révélation par Bromure d'Ethidium, ...)



LIENS UTILES

- Protocole d'extraction et de purification de l'ADN
- QCM purification ADN des plantes (TP S5)
- DNA electrophoresis on agarose gel
- QCM Electrophorèse
- ADN. Structure 3D par JMOL
- Biologie moléculaire. Examen TP S5
- Technique d'électrophorèse Extraction de l'ADN de plasmide, clonage, séquençage. Exercice
- Clonage des gènes et génie génétique
- Biologie moléculaire. Examen TP S5 2016
- ADN. Quantification par spectrophotometrie (TP S3)




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