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ADN purifié. Analyse par électrophorèse عزل الحمض النووي الريبوزي ناقص الأكسيجين بواسطة الكهرتهجير


L'extraction et purification de l'acide désoxyribonucléique (ADN, DNA, الحمض النووي الريبوزي ناقص الأكسيجين) est une étape importante dans l'étude de cette molécule porteuse de l'information génétique.


Sur cette même page: -- Electrophorèse. Introduction -- Gel d'agarose -- Préparation des échantillons (dépôts) -- Lancement de l'électrophorèse -- Révélation de l'ADN par BET --- Interprétation des résultats --- Vidéos du Laboratoire --


Après avoir procédé à l'extraction et la purification de l'ADN des plantes (Première partie du TP S5), (Pour rappel, la purification de l'ADN et sa quantification ont fait l'objet de TP précédents; en S3). Il y'a lieu de passer à son analyse par électrophorèse sur gel d'agarose. Les résultats des traitements de l'ADN (hydrolyse par enzyme de restriction, amplification par PCR) sont tributaire du degré de pureté de l'ADN et de son état intact ou altéré au cours des différentes étapes de la purification.


Eléctrophorèse de l'ADN. Introduction


L'électrophorèse reste l'outil le plus important dans l'analyse qualitative (voir même quantitative) des acides nucléiques (ADN, ARN). Son principe doit être bien compris. Les critères de séparation utilisés sont la taille (poids moléculaire) et l'ionicité (charge électrique). Comme les acides nucléiques sont chargés négativement (grâce au phosphate), le critère de la charge électrique n'est pas comptabilisé dans la séparation (toutes les molécules migrent dans la même direction, +) et les fragments de l'ADN sont séparés uniquement en fonction du poids moléculaire. L'analyse des acides nucléiques (en particulier l'ADN) par électrophorèse consiste d'abord à lui faire subir un traitement préalable dont 1/ coupure (restriction) par une ou plusieurs enzymes de restriction (technique RFLP) ou 2/ amplification de certains fragments (ou régions) par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR, polymerisation chain reaction). En plus des critères de l'ionicité et de la taille, la forme des molécules intervient dans le cas des plasmides (voir ci dessous). De ce fait, l'implication de la forme des plasmides dans l'électrophorèse complique la détermination exacte de leurs tailles.

La complexité d'un génome et sa grande taille rendent impossible l'analyse directe des profils de restriction de l'ADN des eucaryotes. Ceci est dû au nombre élevé des fragments de restriction obtenus après action d'une enzyme de restriction (supérieur à 1000000). Dans la majorité des cas, le profil de restriction obtenu après révélation (ou coloration) de l'ADN montre un voile (ou continuum, smear) représentant tous les fragments de restriction tassés sur le gel (tailles faibles vers +) et difficiles à distinguer.Ce problème est résolu par recours à des techniques supplémentaires qui permettent de mettre en évidence uniquement les fragments interessant l'expérimentateur. Ceci est rendu possible par l'utilisation d'une sonde (probe, مجس) marquée préparée pour réagir spécifiquement (par hybridation) avec des séquences précises à travers la technique de transfert (southern blotting). Pour réaliser cette tâche, il faut effectuer un transfert des bandes d'ADN du gel sur une membrane de nitrocellulose (ou nylon). Une reconstitution d'un film, de l'extraction de l'ADN à son analyse, existe sur CD.

L'éléctrophorèse peut être réalisée horizontalement ou verticalement (avec les gels de polyacrylamide).

Electrophorèse des plasmides. Effet de la forme d'ADN

Les plasmides comme pBr 322, existent sous 3 formes dont l'une peut résulter de l'autre suite à des altérations ou une longue conservations:

- Forme superenroulée montrée par le plasmide bien conservé (supercoiled form, en Anglais).
- Forme relachée ou forme circulaire ouverte (Open circular, nicked circle, en Anglais) se rencontrant lors d'une mauvaise conservation du plasmide et portant une coupure sur un seul brin.
- Forme linéaire (Linear form, en Anglais), pouvant résulter de la digestion du plasmide par les enzymes de restriction. Elle correspond à une coupure sur les deux brins.

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