Biochimie, biotechnologies

ADN. Protocole de purification et analyse par électrophorèse
الحمض النووي الريبوزي ناقص الأكسيجين. تنقية و تحليل بالكهرتهجير
Extraction et Purification de l'ADN
L'extraction et purification de l'acide désoxyribonucléique (ADN, DNA, الحمض النووي الريبوزي ناقص الأكسيجين) fait appel à l'application d'un protocole utilisant un milieu basique, des concentrations élevées en sel (comme NaCl), EDTA et des détergents.
Elle nécessite 3 étapes importantes, dont 1) une action physique, consistant à détruire les structures cellulaires (paroi cellulaire, en particulier) par broyage mécanique, réalisé souvant en présence de l'azote liquide, 2) une action chimique (lyse chimique) tendant à solubiliser les composantes biochimiques du tissu et 3) Une purification (isolation) de l'ADN des autres molécules biologiques comme les protéines, les polysaccharides et les composés phénoliques (séparation par affinité aux phases), précipitation de l'ADN par l'alcool (isopropanol) et Lavage de l'ADN par l'alcool (éthanol 70%)

Purification de l'ADN

Important:
l'efficacité d'un protocole d'extraction et de purification de l'ADN dépend de deux actions principales:
- Déprotéinisation et élimination d'autres impuretés (pour les plantes: sucres, phénols,..)
- Maintenir l'ADN dans un état non dénaturé (hydrolysé par des DNases)
Comme il est réalisé dans les séances des travaux pratiques (TP) du cinquième semestre (S5) de la filière licence science de la vie de la Faculté des Sciences de Marrakech (Université Cadi Ayyad, Maroc), les étudiants font l'extraction et la purification de l'ADN à partir de 4 espèces de plantes (chou-fleur, chou, courgette et courge rouge).


Extraction, purification de l'ADN

إستخلاص، تنقية و تحليل ADN في المختبر
Extraction, purification et analyse de l'ADN au laboratoire في أغلبية المختبرات، تقترن تجارب استخلاص و تنقية ADN بتحاليل تقييمية تستعمل فيها تقنية الكهرتهجير. المزيد عن هذه التقنية موجود بالفقرة المتعلقة بتقنيات عزل و تحليل الجزيئات في البيوكيمياء.


- Mettre 0,8 ml de tampon d'extraction (Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), CTAB 0,3% (p/v), 2-mercaptoéthanol 1% (v/v), EDTA 20 mM et NaCl 1,4 M) dans un microtube de 2 ml. Garder le dans le bac à glace
- Dans un mortier découper le matériel végétal. Ajouter une cuillière d'azote liquide  à -196°C (travailler avec des gants) et écraser le matériel végétal. On obtient une poudre. Transferer la poudre dans le microtube maintenu dans le bac à glace (voir la photo suivante)
- Agiter le microtube à l'aide d'un vortex.
- Mettre le tube dans le bain-Marie à 65°C pendant 20 minutes.
- Récupérer le tube du bain-Marie à 65°C et ajouter 0,8 ml du mélange chloroforme-alcool isoamylique (24 :1). Agiter par inversion pendant 4 minutes, environ.
- Centrifuger le tube pendant 7 minutes à 9000 g, environ.
- A l'aide d'une micropipette, prélever la phase aqueuse (phase supérieure, environ 0,7 ml) contenant l'ADN (+ ARN) et la mettre dans un microtube de 1,5 ml contenant 0,7 ml d'isopropanol refroidi à -20°C (volume à volume.) Agiter le tube par inversion et garder le à -20°C pendant 15 minutes.
 L'isopropanol mobilise toutes les molécules d'eau laissant l'ADN précipiter.
Remarque: A haute force ionique (0,3 M acétate de sodium), l'ADN peut être aussi précipité par l'éthanol (2 volumes/ 1 volume de la solution d'ADN). Aussi l'isopropanol n'élimine pas les sels (lavage avec éthanol devient nécessaire) et supprime les petits fragments d'ADN car non précipités
.

(Ethanol and isopropanol are both used for precipitation of nucleic acids. Ethanol is used at 2 volumes for DNA and 2.5 -3 volumes for RNA and isopropanol at 0.6 to 1 volume of DNA and RNA solutions. The final concentration of ethanol varies from 60%-80% and 30%-50% for isopropanol)
- Centrifuger le tube pendant  7 minutes à 9000 g, environ. Récupérer le culot (ADN avec peu d'ARN).
- Laver le culot avec 0,5 ml d'éthanol 70%. Centrifuger comme avant. Vider le surnageant et sécher suffisamment le culot et bien dissoudre dans 0,050 ml d'eau distillée.
Les traces d'éthanol empêchent la solubilisation de l'ADN dans l'eau.
Lorsque l'ADN reste contaminé avec les protéines et l'ARN, la solubilisation du précipité dans le sel associée à un deuxième traitement avec le mélange chloroforme-alcool isoamylique, permet d'éliminer les protéines. L'ARN peut être éliminé par utilisation de la RNase.


- ضع 0,8 مل من منظم الاستخلاص (pH 8,0) في أنبوب دقيق من سعة 2 مل و احتفظ به في إناء جليد الماء
- قم بتقطيع المادة النباتية داخل مهراس. ضف ملعقة من الأزوت السائل (-196°C) ثم قم بسحق المادة النباتية. نحصل على مسحوق يتم نقله إلى الأنبوب الدقيق المحتفظ به في إناء بجليد الماء. في هذه المرحلة، يجب الاشتغال باستعمال القفازات (أنظر الصورة التالية).
- قم برج الأنبوب الدقيق بواسطة جهاز الرج (vortex)
- قم بإخراج الأنبوب من حمام (65°C) و أضف له 0,8 مل من خليط الكلوروفورم و الكحول الإزوأميلي (chloroforme-alcoolisoamylique (24 :1) ثم حرك الأنبوب بتغيير اتجاهه من الأسفل إلى الأعلى ثم العكس لمدة 4 دقائق
- قم بإخضاع الأنبوب للطرد المركزي تحت 9000 g ، تقريبا و لمدة 7 دقائق.
- بواسطة ماصة دقيقة، قم بأخذ الطور المائي(الطبقة العليا) الذي يحتوي على (ADN+ARN) ووضعه في أنبوب دقيق من حجم 1,5 مل يحتوي على 0.7 مل من الإزوبروبانول بدرجة حرارة -20°C. حرك الأنبوب بتغيير اتجاهه من الأسفل إلى الأعلى ثم العكس ثم احتفظ به في -20°C مدة 15 دقيقة.
- قم بإخضاع الأنبوب للطرد المركزي تحت 9000 g، تقريبا و لمدة 7 دقائق. إحتفظ بالراسب (ADN)  مع قليل من ARN).
- إغسل الراسب ب 0,5 مل من الإثانول 70% ثم قم بالطرد المركزي كالمعتاد. إسحب الرائق و قم بتجفيف الراسب ثم إذابته في 0,05 مل من الماء المقطر. أنظر الصورة التالية للمزيد من التوضيحات.
في حالة بقاء ADN ملوثا بالبروتيتات و ARN ، يمكن التخلص من البروتينات بإذابة  الراسب في وسط ملحي و إعادة استعمال خليط الكلوروفرم و الكحول. يمكن التخلص من ARN باستخدام أنزيم  RNase.


ADN. Purification protocole

إستخلاص، تنقية و تحليل ADN في المختبر
Extraction, purification et analyse de l'ADN au laboratoire


1. سحق المادة البيولوجية (Ecrasement du matériel biologique)
2. إضافة منظم الاستخلاص (Addition du tampon d'extraction)
3. إضافة خليط الكلوروفورم و الكحول (Addition du mélange chloroforme-alcool)
4. ترسيب ADNو ARN (Précipitation de l'ADN et de l'ARN)
5. تحليل ADN (+ARN) بالكهرتهجير(Analyse de l'ADN (+ARN) par électrophorèse)
6. بقع ADN و ARN فوق هلام الأغاروز(Taches d'ADN et d'ARN sur gel d'agarose)


أهمية منظم الاستخلاص
Importance du tampon d'extraction

لا بد أن يستخلص ADN في محلول منظم ذو طابع قاعدي (Caractère basique)، ملحي (Salé) و يحتوي على EDTA (Acide éthylène diamine tétraacétique ou Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, en Anglais). بسبب تأين ADN و حمله لشحنة كهريائية سالبة (-)، فإنه يكون أكثر ثباتا و ذوبانا في المحاليل الملحية أكثر ما يكون في الماء المقطر.


دور الوسط القاعدي Rôle du milieu basique

تكمن أهمية الوسط القاعدي (pH 8,0) في كونه يقلل من التفاعلات الإلكترونية بين ADN و الهيستونات (Histones) القلوية و الأمينات عديدة التكافؤ.  للتذكير، تمتاز الهيستونات ب نقطة PI مرتفعة ، فإذا ارتفع pH الوسط أكثر من هذه النقطة، تكتسب الهيسونات شحنة سالبة مثل  ADN، ليحدث تنافر الشحنات و تنفصل هذه البروتينات عن ADN. كذلك، يحدث انخفاظ في نشاط أنزيم DNase عند ارتفاع درجة pH.

L'un des moyen pour détacher (solubiliser) les histones (protéines à pI très basique, chargées + dans un mileu relativement acide par rapport à leur pI) de l'ADN (chargé négativement) est l'augmentation du pH du tampon d'extraction pour faire acquérir aux protéines une charge similaire (négative) à celle de l'ADN (utilisation de pH supérieurs aux pI des histones) ou neutre (cas où pH de la solution est égal aux pI des protéines). Ceci crée, respectivement, une répulsion entre les deux types de molécules ou un affaiblissement des interactions. Aussi, le pH basique limite l'action des DNases qui peuvent endommager l'ADN. Dautres rôles d'un tampon basique (pH 8,0) sont à considérer, comme l'altération de parois cellulaires, l'altération de l'ARN et l'inactivation des DNases qui risquent de détruire l'ADN.

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دور  التركيز المرتفع للملح (Rôle des concentrations élevées en sel)

تضاف التراكيز المرتفعة  من الأملاح (مثل NaCl) في محاليل استخلاص و تنقية ADN قصد الفصل التام للبروتينات المرتبطة ب ADN و إزالة الرابطة مع الأمينات موجبة الشحنة الكهربائية و يتم ذلك بإضعاف قوة الارتباط الأيوني بين الحمض النووي و كل المركبات ذات شحنة + و المحيطة ب ADN

L'utilisation de concentrations élevées en sel dans l'extraction de l'ADN a pour rôle d'affaiblir la liaison entre l'ADN et les molécules chargées positivement (compétition vis à vis de l'eau).


دور EDTA (Rôle de EDTA)

يعتبر كعنصر لارتباط (Agent chélateur) الأيونات الموجبة (+) ثنائية الشحنة، مثل Mg2+، Mn2+ و Cd2+، التي تكون أملاحا مع مجموعات الفوسفاط الأيونية في الحمض النووي. كذلك، بارتباطه السريع بالأيونات، يقوم  EDTA بتثبيط الأنزيم المحلل ل ADN أو Désoxyribonucléase (DNase) الذي يتطلب أيونات المغنيزيوم (Mg2+) أو المنغنيز (Mn2+) لكي يقوم بوظيفته.

Le rôle de EDTA se résume dans la complexation des ions divalents comme Mg++, nécessaires pour l'activité des DNases. De même, en chélatant les éléments calcium (Ca++), EDTA peut fragiliser les parois cellualires


دور المنظفات (Rôle des détergents)

كثيرا ما يستعمل منظف CTAB في عزل الحمض النووي و هو منظف كاتيوني  يفكك  الدهنيات و يرتبط مع السكريات العديدة. من جهة أخرى، تستخدم المنظفات في فصل معقد ADN و البروتين (عملية إزاحة البروتين، Déprotéinisation) و ذلك بتعطيل التفاعلات الأيونية بين الهيستونات موجبة الشحنة  و ADN السالب الشحنة الكهربائية . عادة يستعمل منظف SDS (Dodécylsulfate de sodium ou Sodium Dodecyl Sulfate, en Anglais) الذي يرتبط بكل ما هو بروتين و يكسبه شحنة سالبة (-) تتنافر مع شحنة ADN. من جانب آخر، يتدخل SDS من خلال إتلافه  للأنزيمات المحللة DNase و غيرها من البروتينات.

Les détergents fragilisent le lien entre l'ADN et les protéines. Ainsi SDS (détergent anionique) charge les protéines négativement et crée une répulsion avavec l'ADN chargé négativement. Le CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide), détergent cationique utilisé dans l'extraction de l'ADN des plantes, détruit les structures lipidiques membranaires et fixe les polysaccharides et polyphénols. Etant cationique, il forme un complexe avec l'ADN.



دور خليط الكلوروفورم مع الكحول الإزوأميلي (Mélange chloroforme-alcool isoamylique)

يستعمل خليط الكلوروفورم مع الكحول الإزوأميلي في فصل الأحماض النووية عن غيرها من المكونات الذائبة. بعد إضافة هذا الخليط إلى مستخلض ADN (+ ARN) ثم القيام بالطرد المركزي، يحصل ظهور 3 طبقات  (أطوار) في الأنبوب الدقيق:
- طبقة عالية مائية (Phase supérieure aqueuse) ، تحتوي على الأحماض النووية
- طبقة وسيطة (فاصلة، (interphase) ، تمثل شريط منضغط من البروتين المموه.
- طبقة عضوية سفلى (Phase organique inférieure)
يتم فصل فصل الأحماض النووية الموجودة بالطور العالي من خلال ترسيبها بكحول الإثانول. يكون ADN (+ ARN) راسبا خيطي الشكل يمكن لفه حول عصا زجاجية أو تركه يكون 'كرة' صغيرة (أنظر الصورة في الصفحة السابقة).


Traitements post-purification de l'ADN

Le degré de purification de L'ADN préalablement extrait doit être évalué. Celui ci doit être suffisamment pur et non dénaturé. Cet état de pureté conditionne l'action des enzymes de restriction dans les expériences d'hydrolyse de l'ADN. L'ADN non pure n'est pas digéré par les enzymes de restriction.

Le degré de prification de l'ADN extrait peut être évalué par spectrophotometrie (voir vidéo explicative de la spectrophotométrie) en mesurant les densités optiques (DO) à 260 nm (Acides nucléiques) et 280 nm (protéines).

- un rapport compris entre 1,8 et 2 correspond à une solution d'ADN pure.
- un rapport inférieur à 1,7 indique une contamination par des protéines.
- un rapport supérieur à 2 renseigne sur une contamination par l'ARN.

Un rapport DO260/DO280 proche de 2 atteste d'une richesse en acides nucléiques (ADN + ARN). Aussi, la concentration d'ADN peut être calculée à partir de la mesure de DO à 260 nm en utilisant un facteur de corrélation: ADN double-brin : DO = 1 correspond à 50 ng/µl, ADN simple-brin : DO = 1 correspond à 33 ng/µl (comme l'ARN simple brin) et ARN : DO = 1 correspond à 40 ng/µl.

Une méthode alternative, s'imposant lorsqu’on ne dispose que de faibles quantités d'ADN, consiste à estimer par électrophorèse sur gel d'agarose la quantité d’acide nucléique par comparaison à une gamme de concentrations connues en utilisant l’intensité de la fluorescence émise par le bromure d’éthidium (BET) lorsque celui-ci est exposé à la lumière UV.
Dilutions successive de l'ADN (TP S5)


DNA dilutions

L'ADN est ensuite analysé par éléctrophorèse sur gel d'agarose (0,8-1,5%, environ)

Voir Séparation de l'ADN par électrophorèse. TP S5


Vidéos du laboratoire (extraits)
ces vidéos et autres illustrations existent aussi sous DVD avec les livres de l'auteur)
- Extraction et purification de l'ADN (Vidéo Ar):



- Extraction de l'ADN (DNA) de folioles de palmier dattier homogénéisation du materiel végétal, déproteination, précipitation du DNA par l'alcool,...)

LIENS UTILES

- QCM purification ADN des plantes (TP S5)
- DNA electrophoresis on agarose gel
- QCM Electrophorèse
- ADN. Structure 3D par JMOL
- Biologie moléculaire. Examen TP S5
- Technique d'électrophorèse Extraction de l'ADN de plasmide, clonage, séquençage. Exercice
- Clonage des gènes et génie génétique
- Biologie moléculaire. Examen TP S5 2016
- ADN. Quantification par spectrophotometrie (TP S3)


Séparation de l'ADN des plantes par éléctrophorèse sur gel d'agarose (TP S5)


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