TAKWEEN. TECHNIQUES D'ANALYSE ET DE SEPARATION EN BIOCHIMIE
Le terme 'chromatographie' ('chromatography', en anglais) vient du Grec 'Khrôma' = couleur et 'Graphein' = écrire) implique une serie de techniques reliées par un principe commun: la migration différentielle des substances à séparer à travers une phase solide poreuse (phase fixe), sous l'impulsion d'un fluides vecteur (phase mobile). Plusieurs variantes de cette technique peuvent se présenter. Elles reposent toutes sur 3 grands principes:
Le support fixe joue un rôle primordial dans la chromatographie d'adsorption. Chaque composé du mélange à séparer migre plus ou moins vite à travers le support fixe relativement polaire (adsorbant). Il s'accumule dans une zone délimitée. Les composés peuvent être identifiés par leurs positions et leurs couleurs. Ensuite, ils peuvent être élués séparement. Les composés se séparent selon leur affinité pour la phase fixe suivant un mécanisme d'adsorption-désorption. L'oxyde d'aluminium est l'adsorbant le plus utilisé. Il est généralement contenu dans des tubes de verre disposés verticalement.
La chromatographie sur papier appartient aux chromatographies de partages. Elle est apparue vers 1944. La séparation des composés d'un mélange est due aux différences de solubilité. Tout dépend du coefficient de partage des composés dans 2 solvants, c'est à dire de leur affinité pour les solvants dont l'un constitue la phase stationnaire et l'autre la phase mobile. La phase stationnaire est retenue sur un support solide (papier (contenant un solvant polaire = eau) ou gel). Les composés plus solubles dans la phase aqueuse se déplacent lentement. Ceux qui sont soluble dans la phase organique migrent relativement plus vite.
Le coefficient de partage (K) d'un composé entre les 2 phases correspond à:
K = (concentration dans la ph. stationnaire)/(concentration dans la ph. mobile).
La séparation des substances peut être aussi exprimée par l'indice Rf (reference front) correspondant (Rf = distance parcourue par une substance divisée par la distance parcourue par l'éluant. Le Rf est difficilement reproductible. C'est pour cela il est préférable de caractériser chaque substance par son indice Rx (Rx = distance parcourue par la substance divisée par la distance parcourue par un corps x pris comme référence).
Exemple 2: séparation d'un mélage d'acides aminés. Dans une phase mobile constituée par un mélange de n-butanol-acide acétique-eau (3:3:1), les acides aminés peuvent être séparés dans l'ordre croissant de leur Rf. Par exemple: l'ordre: CYS, ARG, SER, GLU, ALA, TYR, MET et LEU. La révélation des des acides aminés sur papier est effectuée par pulvérisation de la ninhydrine sur le papier séché (jaune orangé).
Exemple 1: séparation des pigments d'une feuille chlorophilienne.
La séparation d'un extrait de feuilles chlorophyliennes préparé dans l'ether permet de visualiser dans l'ordre croissant de Rf, les pigments: chlorophylle b (vert), chlorophylle a (bleu-vert), xanthophylles (jaune clair) et carotènes
Vidéo:
chromatographie sur papier des acides aminés:
Vidéo: chromatographie sur couche mince des lipides:
Chromatographie bidimensionnelle:
La première séparation (monodimensionnelle) est souvent améliorée par une deuxième chromatographie où le papier séché résultant de la première séparation est tourné de 90°C puis soumis à deuxième séparation en utilisant une autre phase mobile différente de la première.
CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE
La chromatographie sur couche mince appartient aux chromatographies de partage. Elle est apparue vers 1938. Etant une technique de haute sensibilité, elle est indiquée pour la micro-analyse d'extraits de faible volumes. Un faible volume d'extrait est déposé sur une plaque chromatographique dont la partie inférieure est immergée dans un solvant. Celui ci monte par capillarité le long de la plaque et entraine les composés de l'extrait à des vitesses différentes. Ces composés séparés sont rendus visibles par l'emploi de réactifs chimiques.
Le choix des couches fixes dépend des composés à séparer. Ainsi les couches peuvent correspondre à la Silice, la Cellulose, l'Alumine, les Polyamides,...Les plaques sont généralement vendues avec leurs couches specifiées.
CHROMATOGRAPHIE ECHANGEUSE D'IONS
La matrice insoluble porte des charges ioniques qui retiennent les molécules de charges opposées. Les matrices généralement utilisées pour séparer des protéines sont le DiEthylAminoEthyl Cellulose (DEAE-Cellulose) qui est chargé positivement (+) et la CarboxyMéthyl Cellulose (CM-Cellulose) et la Phosphocellulose qui sont chargées négativement (-). Le premier cas donne lieu à une chromatographie échangeuses d'anions. Le second cas correspond à une chromatographie échangeuse de cations.
La force d'association entre les molécules chargées et la matrice dépend de la force ionique et du pH de la solution d'élution.
CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE
C'est le type de chromatographie qui exploite comme crière de séparation une affinité naturelle existant entre deux corps comme celle liant un antigène à un anticorps ou une enzyme à un inhibiteur,...
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