biochimie. Cours, techniques d'analyse et applications en biotechnologies

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Chromatographie sur couche mince (CCM). Séparation des lipides selon le caractère de la polarité

Une partie du travail pratique (TP) lipides de S3 porte sur la séparation des lipides par chromatographie sur couche mince (CCM).

La CCM exploite le critère de la polarité des molécules. Les composés polaires sont plus solubles dans des solvants polaires qu'ils ne l'ont dans des des solvants non polaires.


فصل الدهنيات المختلفة عن طريق كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

Séparation des lipids par chromatographie sur couche mince

في هذا الشغل التطبيقي، سنعتمد خاصية القطبية (Polarité) في فصل دهنيات مختلفة مستخلصة من بذور عباد الشمس (Tournesol) بواسطة مذيبات مختلفة. نستعمل في ذلك تقنية الكروماتوغرافيا فوق الطبقة الرقيقة (Chromatographie sur couche mince (CCM) ou Thin layer chromatography (TLC), en Anglais ).

أساس عملية العزل بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة يرتكز على انتشار مكونات العينة بين طوريين، الطور الثابت (Phase statonnaire)    و الطور السائل المتحرك (Phase mobileحيث ترتبط مكونات العينة بمادة الادمصاص (adsorption) عن طريق القوى القطبية، أساسا. عند استخدام مذيبات غيرقطبية كطور متحرك، ترتبط (تدمص) مكونات العينة القطبية على الطور الثابت (مادة الادمصاص) وبذلك تنفصل المركبات الغيرقطبية عن المركبات القطبية. والعكس صحيح.


Dans ce travail pratique, on exploite le critère de la polarité des molecules dans la separation des lipides extraits à partir du tournesol par différents solvants. Dans ce but, on utilise la technique de chromatographie sur couche mince (CCM) (thin layer chromatography, en Anglais).

Le principe de la chromatographie sur couche mince repose sur la dispersion des molécules de l'échantillon sur deux phases, une phase stationnaire (fixe) et une phase mobile. Les constituants de l'échantillon se fixent sur la matière d'adsorption selon leurs forces liées essentiellement à la polarité.

chromatographie CCM. Cuve

Lors de l'utilisation de solvants apolaires comme phase mobile, les constituants polaires de l'échantillon s'adsorbent sur la phase stationnaire permettant aux composés apolaires d'être détachés et séparés sur le support de migration.


تعد عملية فصل الدهنيات بتقنية كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة من اسهل الطرق وأسرعها ويتم فيها استخدام الألواح الزجاجية المغطاة بطبقة رقيقة من هلام السيليس (سلكا جل، silicagel) الذي يشكل الطور الثابت. يختلف سمك طبقة السلكا جل باختلاف أهداف التجربة. تستخدم مذيبات متعددة في الطور المتحرك لفصل المركبات الدهنية، حيث تختلف وفق درجة القطبية (Degré de polarité) طبقا للمواد المراد فصلها. كمثل لذلك، نذكر Chloroforme:Méthanol:Acide acétique glacial:Eau (60:50:1 :4 v/v)، الذي يصلح لفصل الفسفودهنيات. من الممكن استخدام مذيبات أخرى (أغلبها غير قطبية) وبنسب مختلفة. لكن إضافة نسبة قليلة من المذيبات الأكثرقطبية مثل حمض الخليك أو الماء تهيئ حالة مثلى لفصل الفسفودهنيات والجلسريدات الأحادية والأحماض الدهنية. تعزى قطبية الدهنيات إلى الروابط المزدوجة وموقعها بين ذرات الكاربون والوضع الفراغي وكذلك عدد المجاميع القطبية ودرجة قطبيتها ووضعا Cis-Trans.


La séparation des lipides par chromatographie sur couche mince est une technique facile et rapide à exécuter. Elle utilise des plaques de verre couvertes par une couche mince de gel de silice (silicagel) qui constitue la phase stationnaire. L'épaisseur du gel dépend du but de l'expérience. La phase mobile utilisée dans la séparation des lipides est constituée de variétés de solvants différant par leur degré de polarité et adaptés aux molécules à séparer. Comme exemple, on donne le mélange Chloroforme:Méthanol:Acide acétique glacial:Eau (60:50:1 :4 v/v) adapté à la séparation des phospholipides. Il est possible d'ajouter aux mélanges de petits volumes de solvants plus polaires comme l'acide acétique et l'eau pour séparer les phospholipides, les monoglycérides et les acides gras.


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ترتب المذيبات العضوية المستخدمة في عملية الفصل حسب القطبية من الأقل إلى الأكثر قطبية:

Polarité croissante des solvants : Eher de pétrole < Cyclohexane < Tétrachlorure de carbone < Benzène < Toluène < Dichlorométhane < Ether diéthylique < Chloroforme < Acétate d'éthyle < Pyridine < Acétone < Ethanol < Méthanol < Eau < Acide acétique.

مميزات طريقة CCM
Caractéristiques de la CCM
طريقة سريعة تحتاج من 20 حتى 40 دقيقة
 Rapide, exigeant 20-40 minutes
تستخدم كميات قليلة من المادة المراد فصلها
Utilise des quantités faibles d'extrait à séparer
عملية الفصل واضحة وحادة
Séparation nette et fine
تستعمل أنواع عديدة من السلكا جل مع إمكانية  توسيع سعة اللوح عن طريق زيادة سمك الطبقة التي تغطيه
Utilise plusieurs types de silicagel, avec possibilité d'étendre la capacité de la plaque en augmentant l'épaisseur de la couche sur la plaque
طريقة غير مكلفة ولا تحتاج إلى مهارة فائقة
Technique non coûteuse et n'exige pas de qualification technique supérieure

Extraction des lipides du tournesol

Décortiquer 20 graines de tournesol à répartrir sur deux motier à raison de 10 graines par mortier.

Ajouter 10 ml d'hexane dans le premier mortier et 10 ml du mélange de Folch (Chloroforme:Méthanol (2 :1)) dans le deuxième mortier.

Broyer pendant 10 minutes et transvaser le contenu de chaque mortier dans dans un microtube de 1,5 ml.

-  Centrifuger les tubes pendant 10 minutes à 5000 g. Le surnageant de chaque tube constitue l'extrait de lipides solubilisés par le solvant défini. Les extraits à l'héxane et au Folch sont notés H et F, respectivement.

La séparation des lipides extraits par chromatographie sur couche mince sera faite sur des plaques en verre tapissées d'une couche fine de silice.

En évitant de toucher la silice avec les doigts, tracer, à 3 centimètres du bord inférieur de la plaque, une ligne droite sans décoller la silice. Marquer sur cette ligne quatre points de dépôt séparés par une distance de 1 cm.

A l'aide d'une seringue, déposer au niveau des repères marqués H et F sur la ligne de dépôt, une goutte de chaque extrait lipidique correspondant  (une goutte par point de dépôt). Sur les deux repères marqués S et PL, déposer séparemment une goutte de lipide témoin (cholestérol pour les stérols (S) et un pohospholipide (PL)). Utiliser des seringues différentes correspondant à chacun des extraits et des témoins.

Placer les plaques dans la cuve de développement contenant le chloroforme comme phase mobile. Laisser migrer la phase mobile jusqu'à 3 cm du bord supérieur de la plaque.

A la fin de la migration, retirer la plaque de la cuve et la laisser sécher pendant 15 minutes.

Afin de révéler les lipides, placer la plaque de chromatographie dans une cuve de révélation saturées avec la vapeur d'iode. Laisser incuber 20 minutes

A l'aide d'un crayon, entourer les spots correspondant aux différents lipides.

Voir vidéo TP chromatographie sur couche mince:

Questions

Reproduire sur une feuille le chromatogramme obtenu et identifier les différents composés séparés pour les deux extraits lipidiques.

Donner une comparaison sur l'effet de chaque solvant ou mélange de solvants utilisés dans l'extraction des lipides des graines de tournesol.


Autres liens sur la chromatographie:

La chromatographie en couche mince est caractérisée par un nombre limité de phases stationnaires et de nombreuses phases mobiles.

- La chromatographie Liquide-Liquide comme HPLC est caractérisée par un nombre élevé de phases stationnaires et mobiles.

La chromatographie sur papier est une forme de chromatographie Liquide-Liquide où l'eau est la phase stationnaire et la phase mobile ,moins polaire, peut être constitué d'un mélange de solvants organiques.

- La chromatographie Gaz-Liquide est caractérisée par un nombre élevé de phases stationnaires.

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