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Chromatographie d'interactions hydrophobes (hydrophobic interaction chromatography, كروماتوغرافياالتفاعل الهيدروفوبي)

La chromatographie d'interaction hydrophobe (hydrophobic interaction chromatography, كروماتوغرافياالتفاعل الهيدروفوبي) exploite l'expression de l'hydrophobie des protéines en présence d'une force ionique élevée (concentration élevée en sels)


La chromatographie d'interaction hydrophobe (hydrophobic interaction chromatography, كروماتوغرافياالتفاعل الهيدروفوبي) sépare les protéines en fonction de leur caractère hydrophobe. Son principe repose sur le fait qu'en présence d'une force ionique élevée (fortes concentrations en sels), les molécules d'eau constituant l'enveloppe d'hydratation des protéines sont déplacées pour hydrater les anions et les cations provenant de la dissociation du sel (relargage, salting out). Ceci entraine une réorganisation des molécules d'eau autour des protéines et l'exposition de leurs zones hydrophobes favorisant l'établissement d'interactions hydrophobes entre ces zones (normalement enfouies) et les groupements hydrophobes portés par la phase stationnaire. Les protéines qui se lient à la phase stationnaire réadoptent leur conformation native lorsqu'un tampon avec une force ionique faible est ajouté. Il en résulte une élution des protéines.

Chromatographie d'interaction hydrophobe

Le gel de chromatographie d'interaction hydrophobe porte un groupement hydrophobe comme un noyau phénol à l'extrémité d'une chaîne carbonée. Ce groupe hydrophobe interagit avec les zones hydrophobes situées à la surface des protéines. La chromatographie d'interaction hydrophobe peut être une méthode de séparation précieuse pour la purification des protéines qui peuvent se replier spontanément par une diminution de la force ionique. Cependant, sous crainte de précipitation par les sels d'une protéine d'intérêt, la force ionique du tampon de liaison doit être aussi faible que possible pour lier la protéine, tout en empêchant sa précipitation. Pour éviter le risque de précipitation, une force ionique plus faible peut être utilisée. Dans le cas contraire, il faut faire fixer les protéines contaminantes et récupérer la protéine d'intérêt dans la fraction non retenue.

Procédures: Avant de charger l'échantillon sur la colonne, la phase stationnaire doit être équilibrée avec le tampon de force ionique élevée (le même tampon dans lequel l'échantillon de protéine sera chargé sur la colonne). L'échantillon est ensuite déposé sur la colonne qui est est lavée intensivement. La protéine d'intérêt est éluée avec un tampon de force ionique faible. Ainsi, les ions du sel étant progressivement éliminés, les acides aminés chargés (ou polaires) à la surface de la protéine d'intérêt rétablissent à nouveau des liaisons hydrogène avec la phase mobile, d'où une augmentation de la solubilité de la protéine provoquant son élution.



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Protéines et Enzymes, Baaziz 2013



Types de groupe fonctionnel hydrophobe:

La phase stationnaire utilisée pour la chromatographie d'interaction hydrophobe est composée d'une matrice de base faite d'agarose réticulé ou d'un copolymère synthétique. Un ligand alkyle ou aryle est ensuite conjugué à la matrice de base, fournissant une spécificité pour des molécules hydrophobes.

- Alkyle: une chaîne hydrocarbonée de différentes longueurs; souvent un groupe butyle ou octyle est utilisé. La capacité de liaison de la phase stationnaire est augmentée avec l'augmentation de longueur de chaîne alkyle Les groupes fonctionnels lient des protéines entièrement sur l'hydrophobicité de la protéine
- Aryle: un groupe fonctionnel dérivé d'un cycle aromatique; souvent un groupe phényle. Les groupes aryle offrent spécificité croissante, les protéines peuvent également interagir avec le groupe fonctionnel grâce à des interactions d'empilement de base.

A quelles étapes utilise-t-on la chromatographie d'interaction hydrophobe?

La chromatographie d'interaction hydrophobe est souvent utilisée comme une étape intermédiaire dans un protocole de purification. Les protéines sont liées à une phase stationnaire dans un tampon de force ionique élevée. De ce fait, elle peut typiquement être réalisée immédiatement après la chromatographie par échange d'ions, sans échange de tampon ou de dilution nécessaire. De même, la chromatographie d'interaction hydrophobe est couramment réalisée après une précipitation au sulfate d'ammonium. Parfois la chromatographie d'interaction hydrophobe est applicable dans les premières étapes d'un protocole de purification ou en tant qu'étape finale visant l'élimination des traces d'impuretés de la protéine d'intérêt.

Résolution des problèmes liés à la chromatographie d'interaction hydrophobe

Problème Cause Solution
La protéine ne se lie pas à la colonne La colonne n'a pas été équilibrée Faire passer plus de tampon d'équilibration sur la colonne et recharger la protéine
La force ionique du tampon de liaison est trop faible Augmenter la force ionique du tampon
La protéine s'agrège à la force ionique utilisée Diminuer la force ionique du tampon ou essayer un sel diffèrent
La protéine n'est pas éluée La force ionique du tampon d'élution est trop élevée Diminuer la force ionique
La protéine est agrégée sur la colonne Ajuster les conditions du tampon pour une meilleure stabilité de la protéine
La rétention est trop élevée Essayer une phase stationnaire différente qui offre moins de rétention
Résolution faible Le débit est soit trop élevé ou trop faible Ajuster le débit
La colonne n'a pas été lavée suffisamment Laver avec un tampon de force ionique plus faible, nettoyer la phase stationnaire en suivant les recommandations du fournisseur
La protéine est agrégée sur la colonne Ajuster les conditions du tampon pour une meilleure stabilité des protéines
faible rétention sur la colonne Essayer une phase stationnaire différente qui offre une meilleure rétention
La protéine perd son activité pendant la procédure La protéine est dénaturée ou agrégée Ajuster les conditions du tampon pour une meilleure stabilité des protéines
La protéine n'est pas revenue à sa conformation native Essayer la liaison avec un sel différent ou à une force ionique plus faible, ajouter des additifs permettant une meilleure stabilité de la protéine
Un cofacteur nécessaire à l'activité a été éliminé pendant la purification Ajouter le cofacteur

Plus de détails: http://www.labome.fr/method/Protein-Purification.html


Techniques basées sur le(s) critère(s):- Polarité- Taille- Forme- Ionicité
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