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Etude cinétique de l'invertase extraite de la levure boulangère et effet des inhibiteurs
دراسة حركية أنزيم أنفرتاز المستخلص من خميرة المخبز و تأثير المثبطات

L'invertase (أنزيم أنفرتاز ) est une enzyme de la classe des hydrolases qui coupe la liaison glycosidique qui lie le glucose au fructose dans le sucre (glucide) de table, le saccharose (dissacharide) qui est un glucide non réducteur.

Au cours du TP d'enzymologie S3 la cinétique de l'enzyme ainsi que ses paramètres cinétiques sont déterminés en absence et en présence d'inhibiteurs. Cours (Enzymologie: MOOC)


Invertase. Abeille

?? L'abeille fait les biotechs par son invertase !!!!

النحلة تقوم بالبيوتكنولوجيات بواسطة أنزيمها الأنفرتاز ؟

? Bee is doing biotechnology by its invertase !!!


تقــــــديم - Introduction

L'invertase ou ß-fructofuranosidase, est une glycoside hydrolase qui hydrolyse le saccharose (سكر القصب, sucrose), un fructofuranoside, en glucose et fructose par rupture des liaisons ß fructofuranosiques (voir schéma).

تعد الأنفرتاز أو بيتا فريكتوفورانوزيداز أنزيما للحلمأة يعطي الكليكوز ة الفريكتوز بعد كسر الرابطة الكليكوزيدية التي تربط بين الكليكوز و الفريكتوز (أنظر الرسم).

Inverase. Réaction


Vidéo du TP 'Extraction et étude cinétique de l'invertase de la levure boulangère:

Questionnement: A votre avis, par rapport au goût sucré du sacharose (sucre de table), substrat de l'invertase, comment sera l'intensité de la la saveur sucrée du mélange des sucres résultant de l'action de l'enzyme (sucre inverti)? Quelle application de l'invertase peut-on s'en inspirer? Réponse voir question 11 du QCM Sucres. Quant à l'application, l'invertase conduit au sirop de sucre inverti utilisé par les cuisiniers professionnels pour son pouvoir sucrant supérieur au saccharose (environ 20 %).


Kinetic studies indicate that the extracellular yest form of invertase has a pH and temperature optima of about 4.8 and 40° C, respectively, and the Km for its substrate is about 5 mM sucrose. The enzyme’s native mass of about 270 kiloDaltons is constructed from two identical and heavily glycosylated subunits with a molecular weight of about 135 kiloDaltons (Neumann & Lampen, 1967. Purification and Properties of Yeast Invertase, Biochemistry, Vol. 6, No. 2 (February 1967), pp 468-475, ISSN 0006-2960).

Substrats de l'invertase. L'invertase présente une affinité forte pour le saccharose (beta-fructofuranoside). Néanmoins, elle peut hydrolyser d'autres fructofuranosides comme le raffinose (triholoside constitué de galactose, glucose et fructose) et le stachyose (tétrasaccharide: alpha-D-galactopyranosyl(-6)-alpha-D-galactopyranosyl (1-6)-alfa-D-glucopyranosyl(1-2)-béta-D-fructofuranoside).

Le saccharose (sucrose = beta-fructofuranoside), substrat de l'enzyme, est le sucre le plus répandu des diholosides. Il est extrait de la bettérave sucrière et de la canne à sucre. C'est un sucre non réducteur dextrogyre (à cause du glucose = dextrose) qui libère par hydrolyse chimique ou enzymatique, un mélange équimolaire de glucose (réducteur) et de fructose (peu réducteur). Leur pouvoir rotatoire global est lévogyre (à cause du fructose = levulose). On donne à ce mélange avec un pouvoir rotatoire inversé, le nom de sucre inverti (invert sugar, سكر عكسي). L'enzyme le produisant s'appelle invertase.

يعد السكروز أو سكر القصب من السكريات الثنائية الأكثر انتشارا، يستخلص من الشمندر و قصب السكر و هو سكر غير مختزل يميني، ينتج بالحلمأة الكيميائية أو الأنزيمية، خليطا من الكليكوز و الفريكتوز، متساويا المولية و مختزلان. عكس السكروز يتميز الخليط بقوة تدويرية يسارية. لهذا سمي الخليط بالسكرالعكسي.

Saccharose. Substrat de l'invertase

Saccharose (sucrose): beta-fructofuranoside:
Km saccharose = ??
Vmax saccharose = ??


Stachyose

Stachyose: beta-fructofuranoside:
Km stachyose = ??, Vmax stachyose = ??


يظهر أنزيم الأنفرتاز ألفة عالية تجاه سكر القصب. لكن بإمكانه حلمأة فريكتوفورانوزات أخرى، مثل الرافينوز (سكر ثلاثي يضم الكالكتوز و الكليكوز والفريكتوز).

Raffinose

Raffinose: beta-fructofuranoside:
Km raffinose = ??
Vmax raffinose = ??

? Invertase’s substrate specificity was tested by examining whether it hydrolyzes other alpha-glucosides (maltose, lactose, ..) or other beta-fructofuranosides (raffinose, melezitose, stachyose..), and results indicate invertase is a beta-fructofuranosidase and not an alpha-glucosidase?????. See details


Inhibiteurs de l'invertase. Les inhibiteurs réversibles des enzymes ont pour effet de diminuer la vitesse maximale d'une réaction enzymatique et/ou changer l'affinité de l'enzyme vis-à-vis de son substrat (voir cours d'enzymologie).

Des sucres artificiels (édulcorants), de structure similaire au saccharose, peuvent être synthétisés pour bloquer l'activité de l'invertase. Il s'agit en particulier du sucralose (disaccharide artificiel) où certains groupements hydroxyle (OH) du saccharose ont été remplacés par du chlore (Cl). Considérant cette analogie structurale, le sucralose serait un inhibiteur compétitif vis-à-vis du saccharose.

Maltose, mélibiose

Maltose, Mélibiose = alpha-glucosides:
Km maltose = ??, Km mélibiose = ??
Vmax melibiose = ??, Vmax mélibiose = ??



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Protéines et Enzymes, Baaziz 2013



D'autre part, les sels de métaux lourds, comme Cu++, Hg++ et Ag+ sont des inhibiteurs réversibles de l'invertase. L'activité initiale peut être récupérée en éliminant les métaux lourds par dialyse ou par addition d'agents complexant ces ions.

Dans ce travail pratique, on étudie l'effet du sulphate de cuivre (CuSO4) à faibles concentrations (inférieures à 3 mM) sur l'activité enzymatique de l'invertase de la levure de boulangerie. Cette inhibition est liée à l'affinité que présente Cu++ envers les groupes sulfhydrile des acides aminés cystéine et méthionine de l'enzyme (Greenwood Health Systems, 2009).


بالامكان قياس النشاط الأنزيمي للأنفرتاز بطرق متعددة، من بينها
- الإستقطاب الضوئي : قياس تغير القوة التدويرية للضوء من طرف المحلول السكري بواسطة المقطاب

- قياس السكريات المختزلة المفرزة باستعمال مادة DNS.
L'activité enzymatique de l'invertase peut être mesurée par plusieurs méthodes, dont:

- Polarimétrie : mesure de la variation du pouvoir rotatoire de la solution à l'aide d'un polarimètre.
Dosage des sucres réducteurs libérés par la métode à l'acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS).


مبدأ قياس السكريات المختزلة باستعمال DNS
Principe du dosage colorimétriques des sucres réducteurs par DNS


  في وسط قلوي و تحت التسخين، يختزل الكليكوز و الفريكتوز حمض 3,5-dinitrosalicylique ذو اللون الأصفر إلي حمض 3-amino-5-nitrosalicylique بلون أحمر برتقالي، حيث يمتص الضوء بموجة 540 نانومتر.

En milieu alcalin et à chaud, le glucose et le fructose réduisent l'acide 3,5-dinitrosalicylique (Jaune) en acide 3-amino-5-nitrosalicylique (rouge-orange) absorbant la lumière à 540 nm.

Sucres. Réduction DNS

Plus de détail sur le dosage des sucres réducteurs (gamme-étalon glucose)


إستخلاص أنزيم الأنفرتاز من خميرة المخبز
Extraction de l'invertase à partir de la levure boulangère


يتعلق الأمر باستخلاص الجزء الذائب من خميرة المخبز، علما أن أنزيم الأنفرتاز موجود داخل الخلية، إذ يجب هدم الغشاء الخلوي. فيما بعد نستهدف استكشاف نشاط الأنفرتاز في المستخلص مع استخراج المعلمات الحركية للأنزيم (ثوابت Km وVmax).

 Il s'agit d'extraire la fraction soluble de la levure de boulangerie, sachant que l'invertase est une enzyme intracellulaire, son extraction nécessite obligatoirement la rupture de la membrane cellulaire. L'objectif suivant est de mettre en évidence l'activité invertase dans l'extrait cellulaire et de déterminer les paramètres cinétiques de l'enzyme (Km et Vmax) ainsi que les conditions optimales pour son fonctionnement.

1. Matériel et réactifs

Levure de boulangerie (Saccharomyces cerevisiae)
-
Pipettes
Eprouvettes de 1,5 ml et 10 ml
Tubes à essai en pyrex
Centrifugeuse
Tubes à centrifuger
Mortier et pilon
Fiole de 25 ml
Bain-marie à 100°C et bain-marie à 30°C
Spectrophotomètre
Chronomètre
Tampon citrate de sodium 10 mM (pH 6,0) contenant du beta-mercaptoéthanol 10 mM
Tampon acétate 0,05 M pH 4,7
Triton X-100 (détergent non ionique)
Solution étalon de sucres réducteurs 20 mM (glucose 10 mM + Fructose 10 mM) contenant de l'azoture de Na à 0,02% (1,8 g/l de chaque).
Solution saccharose 0,3 M
Réactif au 3,5-dinitrosalicylate (DNS) solution déjà préparée (5 g de DNS dans 100 ml NaOH 2N + 150 g de tartrate double de Na et K dans 300 ml d'eau. Mélanger et compléter avec de l'eau distillée jusqu'à 500 ml).

2. Mode opératoire

Dans un mortier, suspendre 15 g de levure de boulangerie dans 29 ml de tampon citrate de sodium 10 mM (pH 6,0) contenant du béta-mercaptoéthanol 10 mM. Y ajouter une petite cuillère de sable fin et broyer vigoureusement contre la paroi du mortier pendant 5 minutes.

Ajouter 1 ml de triton X-100 (détergent non ionique) et homogénéiser l'extrait (comparer les différents détergents).

-  Transvaser le contenu du mortier dans un tube à centrifuger. Boucher le tube et agiter vigoureusement pour permettre au triton X-100 de solubiliser les lipides membranaires et libérer l'invertase membranaire.

-    Centrifuger 15 minutes à 7000 g. On récupère le surnageant qui constitue l'extrait brut (extrait F). Conservé dans la glace, il est utilisé pour tester l'activité de l'invertase de la levure de boulangerie.

 Pour les tests enzymatiques, on prépare à partir de l'extrait F une solution d'enzyme diluée 25 fois dans l'eau distillée. Cette solution est conservée dans la glace.

Préparation de la gamme étalon de sucres réducteurs

L'hydrolyse du saccharose (disaccharide non réducteur) libère le glucose et le fructose, deux monosaccharides réducteurs (le fructose moins réducteur que le glucose) dont la concentration reste à déterminer. Pour doser ces sucres réducteurs libérés dans la solution invertie, on prépare d'abord une gamme étalon de sucres réducteurs (glucose + Fructose: saccharose hydrolysé). Ainsi, différents volumes d'un un mélange équimolaire de glucose et de fructose (saccharose hydrolysé) à concentrations connues, sont traités avec le DNS à chaud (dans milieu alcalin).

On organise les tubes de la gamme étalon suivant le tableau ci contre. A son état réduit par les sucres, le DNS absorbe la lumière à 540 nm. Ainsi, on aura une gamme étalon (DO à 540nm = f(quantité de sucres réducteurs) utile pour évaluer la concentration en sucres réducteurs provenant de l'action de l'invertase et dont on connait uniquement l'absorption connue à 540 nm (DO à 540nm). Pour cela on prépare une série de 5 tubes numérotés de G0 à G4 contenant des quantités croissantes d'une solution étalon de saccharose hydrolysé à 10 mM (glucose 10 mM + fructose 10 mM) qu'on traitera avec le DNS suivant le tableau 
Sucres réducteurs. Dosage DNS

Après addition du DNS dans tous les tubes, agiter au vortex et incuber dans le bain-marie à 100°C pendant 5 minutes. Après incubation, refroidir les tubes à +4°C et ajouter dans chaque tube 4 ml d'eau distillée.

Après agitation des tubes au vortex, mesurer l'absorbance à 540 nm au spectrophotomètre. Le zéro d'absorbance est réglé à l'aide du tube 0, ne contenant pas de sucres réducteurs.

sucres. Doasage DNS

Spectrophotometrie: loi de beer Lambert :
-> Exercice spectrophotométrie

Remarque : Toutes les opérations commençant par l'addition de DNS jusqu'à la lecture de l'absorbance, seront à refaire de la même façon pour le dosage des sucres réducteurs libérés dans les milieux réactionnels des tests suivants (voir tableau ci dessus pour le cas de l'expérience vi = f(temps).

 Représenter graphiquement sur papier millimetré, l'absorbance à 540 nm en fonction de la quantité de sucres réducteurs, exprimée em µmoles, dans chaque tube. La gamme-étalon (droite) servira pour déterminer la quantité de saccharose hydrolysée par l'invertase dans les réactions enzymatiques suivantes. Voir un exemple de courbe de la gemme étalon.


Cinétique d'hydrolyse du saccharose en fonction du temps par l'invertase de l'extrait brut F

 Cette expérience est réalisée selon le tableau ci dessus 

-  Suivant l'ordre du tableau, remplir tous les tubes avec le Saccharose 0,3 M (substrat de l'enzyme) et le tampon acétate 0,1 M.
Pour le tube témoin (tube 0), l'ajout de l'extrait d'invertase est précédé par l'addition du DNS. Ceci permet l'arrêt immédiat de la réaction, car la solution de DNS a un pH très basique (voir composition de la solution de DNS), ne permettant pas le démarrage de la réaction.

-  Disposer tous les tubes dans un bain-marie à 30°C.   
-  A l'aide d'une pipette, prélever 6 ml d'extrait F dilué et au temps 0 (utiliser un chronomètre), ajouter rapidement dans chaque tube 1 ml de l'extrait F dilué, agiter les tubes et laisser incuber au bain-marie à 30°C. Remarque: ici, on déclenche la réaction par addition de l'enzyme. Dans d'autres situations, la réaction peut être déclenchée par ajout du substrat
-  Après 2 minutes d'incubation, retirer le tube N°1, ajouter 1 ml de DNS (arrêt de la réaction) et agiter vigoureusement au vortex. Déposer le tube hors bain-marie, à côté du tube témoin. Refaire la même opération pour les tubes 2, 3, 4 et 5 après 4, 6, 8 et 10 minutes d'incubation, successivement.
Mettre tous les tubes, en même temps, dans le bain-marie à 100°C et laisser incuber 5 minutes.
Refroidir et compléter tous les tubes, comme indiqué dans le tableau.

A l'aide d'un spectrophotomètre, régler le zéro d'absorbance de la lumière à 540 nm en utilisant le tube témoin (tube 0). Mesurer les absorbances des autres tubes à la même longueur d'onde.

Que se passe-t-il dans les tubes lors du chaffage à 100°C en présence du DNS (milieu alcalin)?.

La réaction enzymatique catalysé par l'invertase génère 2 hexoses différents (Saccharose + H2O ---- D-Glucose (dextrose) + D-Fructose (levulose). Le glucose (aldohexose) est un sucre réducteur. Par contre, le fructose (cétohexose) présente un faible pouvoir réducteur. Ce pendant, dans un milieu alcalin et en présence du chauffage (100°C) le fructose subit l'isomérisation en glucose (voir figure) et permet de doubler le taux de sucres réducteurs prduits. Voir aussi interconversion.

Isomérisation fructose-glucose

Détermination de la vitesse initiale de la réaction enzymatique catalysée par l'invertase.

A l'aide de la gamme étalon du dosage des sucres réducteurs, préalablement tracée, déterminer par projections des valeurs de DO sur la droite (gamme étalon), les quantités (µmoles) des sucres résultant de l'action de l'invertase sur le saccharose après 2, 4, 6, 8 et 10 min d'incubation à 30°C.

- Tracer la courbe représentant la quantité de sucres réducteurs (en µmoles) en fonction du temps d'incubation. A l'aide du tracé de la tangente, en déduire la vitesse initiale (vi) de la réaction en µmoles de sucres réducteurs libérés par minute (voir la figure ci contre illustrant un exemple de cinétiques obtenues avec 3 concentions d'une invertase).

Calculer la vitesse initiale en µmoles de saccharose hydrolysé par minute (unité, U). Déterminer le nombre d'unités contenu dans 1 ml d'extrait F non dilué.

vitesse initiale

Remarque.

Pour raison de commodité (réduire le temps des tests), on déterminera les vitesses initiales des réactions suivantes en adoptant un seul temps d'incubation de l'enzyme avec le substrat, fixé à 5 minutes. La quantité de saccharose hydrolysé sera donc divisée par 5 pour trouver la vitesse initiale (vi) en µmoles de saccharose hydrolysé par minute.


Etude de l'influence de la concentration en substrat sur la vitesse de réaction et effet du sulfate de cuivre sur l'invertase.
L'influence de la concentration du sbstrat (saccharose) et l'effet du sulfate de cuivre sont étudiés sur la même série d'expérience. En plus d'un tube témoin (tube 0), on teste l'influence de 4 concentrations de saccharose correspondant à 4 volumes différents (0,2 ml, 0,3 ml, 0,4 ml et 0,6 ml) d'une solution mère de saccharose 100 mM. Le tube témoin contient 1 ml d'eau à la place du saccharose (tube 0).

Le test est répété deux fois, avec les mêmes concentrations de substrat, mais en ajoutant séparément 0,2 ml et 0,4 ml d'une solution de sulfate de cuivre de concentration égale à 15 mM. Pour réaliser cette expérience on utilise 13 tubes numérotés de 0 à 12. Ils sont préparés selon les 3 tableaux suivants:

cinétique +/- inhibiteur

- Calculer les concentrations finales du saccharose dans chaque tube (3 ml de mélange réactionnel).

Calculer les concentrations finales du sulfate cuivre dans chaque tube (3 ml de mélange réactionnel).

A l'aide de la gamme étalon du dosage des sucres réducteurs, déterminer les quantités (µmoles) de ces sucres résultant de l'action de l'invertase sur le saccharose en absence de CuSO4 (tube 1 au tube 4) et en présence des deux concentrations de sulfate de cuivre (tube 5 au tube 12). En déduire la quantité de saccharose hydrolysé en µmoles pour chaque tube.

Sachant que la réaction d'hydrolyse du saccharose a duré 5 minutes, déterminer la vitesse initiale (vi) en µmoles de saccharose hydrolysé par minute pour chaque concentration finale de saccharose, en absence et en présence de CuSO4.

Organiser les vitesses obtenues dans un tableau à entrée double. Placer horizontalement, les concentrations finales en saccharose des 12 tubes (numérotés 1 à 12). Verticalement, placer les concentrations finales en CuSO4, y compris la concentration 0 mM. Le tableau final sera à 36 cases devant être remplies par les vitesses initiales correspondantes. Dans un tableau similaire, on peux organiser les données en faisant mention des inverses des concentrations (1/(S)) et les inverses des vitesses initiales (1/vi).

-   Sur le même graphique, tracer les trois lcourbes 1/vi = f(1/(S)) ou ou représentation de Linweaver-Burk (voir les autres représentations possibles), montrant les activité de l'invertase en absence de sulfate de cuivre ((CuSO4) = 0 mM) et en présence de cet inhibiteur (avec deux concentrations). En déduire les valeurs de Vmax et Km de l'invertase de la levure de boulangerie en absence et en présence du sulfate de cuivre. Comparer l'affinité de l'invertase vis-à-vis du saccharose en absence et en présence de CuSO4.

Quel type d'inhibition exerce le sulfate de cuivre vis-à-vis du saccharose pour affecter l'activité de l'invertase de levure de boulangerie ? Justifier vos réponses.

inibiteur non compétitif

The presence of heavy metal ions such as Cu2+ may inhibit the activity of invertase. This is due to the high affinity of the sulfhydryl group on cysteine and methionine residues in a protein for the Cu2+ ion.


Remarque: d'après Asare-Brown & Bullock, 1988, Biochemical education 16 (2), p. 98: 'Substrate inhibition At 40°C a marked depression of invertase activity at sucrose concentrations above 0.3 M is apparent (Fig). At the higher sucrose concentrations, the reaction medium becomes highly viscous and regular agitation to ensure mixing is vital to obtain consistent results. The inhibition is temperature dependent, and an investigation to find the optimum temperature/substrate concentration combination is an interesting class exercise'.

Substrate inhibition of invertase has been attributed to both increased viscosity and changes in the activity of water associated with concentrated sucrose solutions (Invertase = hydrolase). However, Combes and Manson demonstrated that artificially increasing the viscosity of dilute sucrose solutions, using reagents such as carboxymethyl- cellulose, had no significant effect on invertase activity. Conversely, the use of reagents known to have a high affinity for water such as poly(1,2-ethanediol), resulted in a marked depression of activity, suggesting that water activity is in fact the key factor'

invertase. Substrate inhibition

Faire un QCM sur l'invertase

QCM


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