TECHIQUES
D'ANALYSE DU PROTEOME.
INTRODUCTION A LA PROTEOMIQUE
1.
DEFINITION DU PROTEOME
- Le protéome est l'ensemble des protéines produites par
un génôme (ordre de 60000 protéines chez l'Homme).
- Le protéome résulte de la traduction du génôme
en protéines dans des conditions de vie définies. Il varie
selon le type des cellules, leurs activités et leur environnement.
- La taille du protéome est plus importante que celle du génôme,
car un gène peut coder pour plusieurs protéines en considérant
les modifications introduites par la maturation des mRNA et les modifications
post-traductionnelles (glycosylation, phosphorylation,...). Le protéome
est dynamique, le génome est constant.
2.
PRINCIPALES ETAPES DE LA PROTEOMIQUE
- Extraction des protéines et préparation des échantillons
- Séparation des protéines (Electrophorèse bidimensionnelle,
Chromatographie liquide)
- Détection et quantification des protéines
- Identification des protéines par spectrométrie de
masse 
La
protéomique exige l'utilisations d'échantillons biologiques
de qualité. L'extraction de protéines à
partir de tissus, de cellules isolées ou de liquides physiologiques
est réalisée à l'aide de tampons appropriés
mis au point en considérant la nature des protéines à
étudier (protéines cytosoliques, membranaires, nucléaires…).
Les tampons d'extraction à pH bien déterminé, sont
constitués dans des proportions variables, de mélanges
d'agents réducteurs, de détergents, voire de solvants
organiques. Ils sont généralement supplémentés
d'inhibiteurs de protéases.
Les protocoles experimentaux doivent éviter les contaminations
par des acides nucléiques, des lipides et les sels. Ces contaminants
peuvent perturber la séparation des protéines par électrophorèse
bidimensionnelle ou par chromatographie liquide.
Les protéines hydrophobes telles que les protéines membranaires
sont difficiles à solubiliser. De même, les protéines
très basiques, telles que les histones et les protéines
ribosomales, sont peu visibles sur un gel 2D après une isoélectrofocalisation.
De façon générale, la protéomique fait appel à l'utilisation de l'électrophorèse bidimensionnelle (2D) hautement résolutive et la spectrométrie de masse qui associée à l'analyse informatisée des gels, permet de visualiser et de mesurer des variations de quantité de protéines entre différents échantillons. Les protéines identifiées par spectrométrie de masse sont comparées aux protéines des banques de données disponibles sur internet.
L'électrophorèse 2D est la méthode de choix pour séparer les protéines puisqu'elle permet de séparer simultanément plusieurs milliers de polypeptides d'un mélange complexe en fonction de deux propriétés différentes : la charge éléctrique et le poids moléculaire.
Dans la première dimension, les protéines sont soumises à une électrophorèse dans un gel présentant un gradient de pH continu. Au cours de cette étape, appelée isoélectrofocalisation (IEF), elles migrent dans le gel jusqu'à une position où la valeur du pH est égale à celle de leur point isoélectrique (pI) où leur charge globale devient nulle. Cette première séparation est délicate et dépend beaucoup de la préparation des échantillons biologiques qui doit permettre une solubilisation maximale des protéines et empêcher leur agrégation et leur dégradation.
Dans la deuxième dimension, les protéines sont séparées par la technique SDS-Page (sodium-dodécyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis). La résolution s'effectue sur un gel réticulé constitué de polyacrylamide en présence d'un agent dénaturant, le sodium-dodécyl sulfate (SDS). Grâce à la réticulation plus ou moins importante du gel de polyacrylamide, les protéines sont séparées par tamisage moléculaire, leur vitesse de migration dans le gel étant inversement corrélée à leur taille. Comme pour l'IEF, plus le gel de deuxième dimension est grand, plus la résolution (et donc le nombre de spots séparés) augmente.
2.3. Détection et quantification des protéines
Après
l'électrophorèse 2D, les protéines séparées
sont détectées par coloration des gels. Plusieurs procédés
de sensibilité différente existent et sont choisis en fonction
de l'utilisation ultérieure des gels 2D : le bleu de coomassie
permet de détecter un minimum de 100 ng de protéine
par spot et présente l'avantage de donner une intensité
de coloration proportionnelle à la quantité de protéines.
Etant mille fois plus sensible que le bleu de coomassie, la coloration
au nitrate d'argent permet de détecter des spots contenant
0,1 ng de protéines. Elle présente néanmoins certains
inconvénients : la stœchiométrie de la coloration n'est
pas totalement linéaire, la reproductibilité est difficile
à obtenir et certaines protéines sont peu ou pas colorées
par cette méthode. Plus récemment, la détection des
spots par fluorescence (Sypro Orange, Sypro Red, Sypro Ruby) a
été développée, avec une sensibilité
et une linéarité d'intensité de coloration équivalente
à celle de l'argent, mais avec une reproductibilité, une
facilité et une rapidité meilleures que celles de la coloration
au nitrate d'argent.
En dernier lieu, notons que l'autoradiographie des gels 2D après
incorporation dans les protéines d'isotopes radioactifs comme le
35S ou le 32P/33P est extrêmement sensible. En effet, elle permet
de visualiser des quantités très faibles de protéines
(de l'ordre de 1 à 100 pg).
Depuis les années 1970, les méthodes d'analyse des gels
ont évolué grâce aux progrès combinés
de l'informatique et de l'analyse d'images. La
digitalisation des gels consiste en une transformation de l'image
expérimentale en une information numérique utilisable par
l'ordinateur.
Spectrométrie de masse et recherche dans les banques de données
L'avancée majeure en termes d'identification des protéines des gels 2D (1993-1994) correspond à l'utilisation conjointe de la spectrométrie de masse et des banques de données. En s'adaptant à la biologie structurale, la spectrométrie de masse a permis de déterminer avec une sensibilité et une précision extrêmes la masse des molécules. Un spectromètre de masse se compose d'une source où s'effectuent l'ionisation et la désorption des ions, d'un analyseur où les ions sont séparés en fonction de leur rapport masse sur charge (m/z) et d'un détecteur permettant l'enregistrement et la quantification des ions.
Pour
l'étude des composés peptidiques, deux modes d'ionisation
sont principalement utilisés :
- la désorption/ionisation laser assistée par matrice (Maldi-Tof)
qui permet de réaliser une empreinte peptidique après digestion
protéolytique (empreintes peptidiques)
- la spectrométrie de masse en tandem en mode nanospray (MS-MS)
qui permet d'obtenir une microséquence en acides aminés.
LIENS UTILES
-
Electrophoresis 2D & proteomics: http://www.aber.ac.uk/~mpgwww/Proteome/Tut_2D.html
- Spectromètre de masse: http://www.rocler.qc.ca/pdubreui/masse/Ms1/spectro_masse1.html
-
Protéomique: http://perso.orange.fr/fguillonneau/proteomique.html
- Proteomic quiz: http://www.chemsoc.org/ExemplarChem/entries/2002/proteomics/quiz.htm
- Protein identification by peptide mass fingerprinting tutorial: http://www.aber.ac.uk/~mpgwww/Proteome/MS_Tut.html
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