Techniques d'analyse des proteines. Proteomique

QUESTION 2: Afin d'étudier par voie de la protéomique les changements affectant des cellules cancéreuses chez l'Homme, des auteurs ont procédé à la préparation d'échantillons protéiques à partir de cellules saines et de cellules malades.
Le tampon de lyse utilisé dans cette étude est constitué d'une solution contenant, entre autres, CHAPS (détergent non ionique) 4% (p/v) et Tris-HCl (pH 7,8) 40 mM.
L'électrophorèse en première dimension est une isoélectrofocalisation sur un gradient de pH 4,7-5,9 effectuée dans un tampon composé de l'urée 8 M, CHAPS 2% (p/v), Ampholyte 0,2% (p/v), Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v) et le bleu de Bomophénol 0,001% (p/v)
Avant la réalisation de l'électrophorèse SDS-PAGE (deuxième dimension), les gels de la première électrophorèse ont subit l'équilibration dans deux tampons de compositions suivante :

1er tampon d'équilibration (pH 7,0): urée 6 M, Glycérol 20% (v/v), Tris-HCl 1,5 M, SDS 2% (p/v) et DTT 130 mM.
2ième tampon d'équilibration (pH 7,8): urée 6 M, Glycérol 20% (v/v), Tris-HCl 1,5 M, SDS 2% (p/v) et iodoacétamide 135 mM.
L'électrophorèse en SDS-PAGE a été réalisée sur un gradient 4-20% en polyacrylamide dans un tampon de pH 8,3 contenant Tris 25 mM, Glycine 192 mM et SDS 0,1% (p/v).

Après coloration, trois protéines ; P1, P2 et P3 d'intensité variable selon l'état des cellules (normales ou cancéreuses) apparaissent sur les gels de la deuxième dimension. Elles sont identifiées par leurs coordonnées de points isoélectriques (PI) et de poids moléculaires (PM) qui sont (4,8, 20), (5,3, 40) et (5,8, 80) pour P1, P2 et P3.


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EXAMEN DE L'ELEMENT DE MODULE : TECHNIQUES D'ANALYSE DU PROTEOME. INTRODUCTION A LA PROTEOMIQUE MODULE 'OUTILS ET METHODOLOGIES', MASTER : SCIENCE DE LA VIE ET DE LA SANTE Session d'Avril 2007. Durée : 1 heure QUESTION 1: L'étude biochimique approfondie d'une protéine a permis d'élucider sa structure oligomérique comme étant une composition de deux chaînes A (PM : 20 Kd chacune) et deux Chaînes B (PM : 40 Kd chacune) liées par des liaisons faibles et des ponts dissulfure suivant le schéma ci-dessous :
	Avant d'analyser la protéine par électrophorèse sur gel de polyacylamide en présence de SDS, trois traitements différents ont été réalisés : Traitement 1 : incubation de la protéine en présence de SDS 1% (p/v) et urée 8 M. Traitement 2 : incubation de la protéine en présence de SDS 1% (p/v), urée 8 M et Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v). Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v) Traitement 3 : incubation de la protéine en présence du Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v), uniquement. 1. Rappeler le rôle des composés : SDS, DTT et urée. 2. Schématiser les profils électrophorétiques correspondant à chaque traitement de la protéine. Justifier votre réponse.

QUESTION 2: Afin d'étudier par voie de la protéomique les changements affectant des cellules cancéreuses chez l'Homme, des auteurs ont procédé à la préparation d'échantillons protéiques à partir de cellules saines et de cellules malades. Le tampon de lyse utilisé dans cette étude est constitué d'une solution contenant, entre autres, CHAPS (détergent non ionique) 4% (p/v) et Tris-HCl (pH 7,8) 40 mM. L'électrophorèse en première dimension est une isoélectrofocalisation sur un gradient de pH 4,7-5,9 effectuée dans un tampon composé de l'urée 8 M, CHAPS 2% (p/v), Ampholyte 0,2% (p/v), Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v) et le bleu de Bomophénol 0,001% (p/v) Avant la réalisation de l'électrophorèse SDS-PAGE (deuxième dimension), les gels de la première électrophorèse ont subit l'équilibration dans deux tampons de compositions suivante : 1er tampon d'équilibration (pH 7,0): urée 6 M, Glycérol 20% (v/v), Tris-HCl 1,5 M, SDS 2% (p/v) et DTT 130 mM. 2ième tampon d'équilibration (pH 7,8): urée 6 M, Glycérol 20% (v/v), Tris-HCl 1,5 M, SDS 2% (p/v) et iodoacétamide 135 mM. L'électrophorèse en SDS-PAGE a été réalisée sur un gradient 4-20% en polyacrylamide dans un tampon de pH 8,3 contenant Tris 25 mM, Glycine 192 mM et SDS 0,1% (p/v). Après coloration, trois protéines ; P1, P2 et P3 d'intensité variable selon l'état des cellules (normales ou cancéreuses) apparaissent sur les gels de la deuxième dimension. Elles sont identifiées par leurs coordonnées de points isoélectriques (PI) et de poids moléculaires (PM) qui sont (4,8, 20), (5,3, 40) et (5,8, 80) pour P1, P2 et P3.	La figure suivante représente une zone du protéinogramme couvrant les PI de 4,7 à 5,9 et les PM de 20 Kd à 80 Kd. Les 3 protéines d'intérêt sont indiquées par une flèche.
Les protéinogrammes de la deuxième dimension ont été comparés à ceux de la base de données SWISS-2-DPAGE (http://expasy.org/ch2d). Après leur élution des gels, les protéines d'intérêt ont été soumises à une digestion par la trypsine dans un mélange constitué de bicarbonate d'ammonium 25 mM et de la trypsine 0,02% (p/v). Les peptides résultant de l'action de la trypsine sont identifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les empreintes peptidiques obtenues sont comparées à la base de données Suiss-Prot ave le moteur de recherche MASCOT. 1/ Préciser les quantités ou les volumes des réactifs nécessaires pour la préparation de : - 70 ml du deuxième tampon d'équilibration - 150 ml de tampon d'électrophorèse SDS-PAGE. On donne les PM suivants : urée : 60,06, Tris : 121,14, iodoacétamide : 184,96, Glycine : 75,07	2/ Rappeler le rôle du CHAPS et de l'iodoacétamide 3/ Rappeler le mode d'action de la trypsine 4/ Rappeler la signification d'une empreinte peptidique générée par spectromètrie de masse MALDI-TOF. 5/ Préciser sur l'électrophorégramme les protéines P1, P2 et P3. Justifier vos réponses Revenir a: COURS (EXTRAIT) / TD biotechnologies et environnement

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