La préparation d'échantillon a été réalisée en présence d'un tampon de lyse constitué d'une solution contenant l'urée 8M, CHAPS (détergent non ionique) 4% (p/v) et Tris-HCl (pH 7,8) 40 mM.

L'électrophorèse en première dimension est une isoélectrofocalisation sur un gradient de pH 4,7-5,9 effectuée dans un tampon composé de l'urée 8 M, CHAPS 2% (p/v), Ampholyte 0,2% (p/v), Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v) et le bleu de Bomophénol 0,001% (p/v)

Avant la réalisation de l'électrophorèse SDS-PAGE (deuxième dimension), les gels de la première électrophorèse ont subit l'équilibration dans deux tampons de compositions suivante :

Premier tampon d'équilibration (pH 7,0): urée 6 M, Glycérol 20% (v/v), Tris-HCl 1,5 M, SDS 2% (p/v) et DTT 130 mM.
Deuxième tampon d'équilibration (pH 7,8): urée 6 M, Glycérol 20% (v/v), Tris-HCl 1,5 M, SDS 2% (p/v) et iodoacétamide135 mM.

L'électrophorèse en SDS-PAGE a été réalisée sur un gradient 4-20% en polyacrylamide dans un tampon de pH 8,3 contenant Tris 25 mM, Glycine 192 mM et SDS 0,1% (p/v).
Après coloration, les protéines d'intérêt apparaissent sur les gels de la deuxième dimension sous forme de spots d'intensité variable selon la température du choc thermique et sa durée d'application.
Les protéinogrammes de la deuxième dimension ont été comparés à ceux de la base de données SWISS-2-DPAGE (http://expasy.org/ch2d).

Après leur élution des gels, les protéines d'intérêt ont été soumises à une digestion par la trypsine dans un mélange constitué de bicarbonate d'ammonium 25 mM et de la trypsine 0,02% (p/v).
Les peptides résultant de l'action de la trypsine sont identifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les empreintes peptidiques obtenues sont comparées à la base de données Suiss-Prot ave le moteur de recherche MASCOT.

Les résultats suivants ont été obtenus :
Protéinogrammes de l'électrophorèse en double dimension (voir ci contre)

Empreinte peptidique de la protéine dnaK obtenue par spectrométrie de masse

Les masses des pics intéressants de l'empreinte peptidique de la protéine dnaK sont reportées ci-dessous :

1050.5412
1179.6231
2346.0767
2441.2316
2653.2858
2869.6317

1/ Technique d'électrophorèse :
1/ Préciser les quantités ou les volumes des réactifs nécessaires pour la préparation de :
- 60 ml du tampon de lyse
- 80 ml de tampon d'isoélectrofocalisation
- 50 ml du deuxième tampon d'équilibration
- 200 ml de tampon d'électrophorèse SDS-PAGE.

2/ Rappeler le rôle des composés : Triton X-100, DTT, urée, CHAPS, iodoacétamide et SDS.
3/ Rappeler le mode d'action de la trypsine

2/ Identification des protéines par spectrométrie de masse :
Caractérisez la protéine dnaK en utilisant la base de données Swiss-Prot et avec les moteurs de recherche:

Mascot : http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF
Profound : http://bioinformatics.genomicsolutions.com/prowl-cgi/ProFound.exe
MS-FIT : http://prospector.ucsf.edu/prospector/4.0.8/html/msfit.htm
Aldente : http://www.expasy.org/tools/aldente/

LIENS UTILES

- Electrophoresis 2D & proteomics: http://www.aber.ac.uk/~mpgwww/Proteome/Tut_2D.html
- Spectromètre de masse: http://www.rocler.qc.ca/pdubreui/masse/Ms1/spectro_masse1.html
- Protéomique: http://perso.orange.fr/fguillonneau/proteomique.html
- Proteomic quiz: http://www.chemsoc.org/ExemplarChem/entries/2002/proteomics/quiz.htm
- Protein identification by peptide mass fingerprinting tutorial: http://www.aber.ac.uk/~mpgwww/Proteome/MS_Tut.html

,