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Spectrophotometrie. Exercices

La sectrophotometrie exploite l'absorption des molécules dans une longueur d'onde déterminé du spectre pour identifier et évaluer la concentration de ces molécules. Elle utilise le spectrophotomètre pour atteindre ces buts.

De nombreuses molécules peuvent être dosées par spectrophotometrie, dont les protéines (dosage des protéines) et es sucres ( dosage des sucres réducteurs par DNS)

Vocabulaire:

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Français
إمتصاصية
Absorbance, Optical density
Absorbance, Densité optique  
مطياف
Spectrophotometer 
Spectrophotomètre
المطياف يقيس كمية الضوء الممتصة من طرف عينة في طول موجة محددة
A spectrophotometer measures  the amount of light that is absorbed by a sample at a fixed wavelength.
Le spectrophotomètre mesure la lumière absorbée par un échantillon pour une longueur d'onde fixée.

Exercice 1 (spectrophotometrie) -- Réponse 1. Quelle est la concentration de l'acide amine tyrosine sachant qu'il a une absorbance de 0,70 obtenue à une longueur d'onde (lambda) précise en utilisant une cuve de spectrophotomètre de 1 cm d'épaisseur. Le coefficient d'extinction molaire pour Lys (Epsilon) est 1 420 M-1 x cm-1). Quelle sera l’absorbance d’une solution de 0,35 mM de tyrosine?
Exercice 2 (spectrophotometrie) -- Réponse 2. Pour determiner la concentration d'hémoglobine dans un echantillon de sang par
spectrophotometrie, on prépare une courbe standard d'absorbance a 412 nm de plusieurs
solutions d'hemoglobine de concentrations connues. Les resultats obtenus sont presentées dans le tableau ci-dessous. Quelle est la concentration (en µg/ml) en hemoglobine dans un échantillon d'hémoglobine préentant une DO à 412 nm égale à 0,45?
Concentrations en hémoglobine
standard (µg/ml)
Densité optique à 412 nm
1 0,070
2 0,114
4 0,202
8 0,378
16 0,731

Exercice 3 (spectrophotometrie) -- Réponse 3.
Le nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH) est le coenzyme de nombreuses déshydrogénases.

a- Calculer l'absorbance à 340 nm et à 260 nm d'une solution de NADH à 0,05 g/litre, placée dans une cuve dont le trajet optique est de 1 cm. PM signifie le poids moléculaire, K signifie le coefficient d'extinction molaire (unites : M-1 x cm-1)
PM NADH = 709 g/mol
K NADH (à 340 nm) = 6 220 M-1cm-1
K NADH (à 260 nm) = 15 400 M-1cm-1

b- Au cours d'une manipulation, lon réalise 5 ml d'un mélange NADH/NAD+ mais on a oublié de noter les concentrations respectives sur le flacon. Pour trouver ces valeurs, on a effectué des mesures au spectrophotomètre avec une cuve de 1 cm de trajet optique :
DO340nm = 0,44
DO260nm = 1,31

Quelles sont les concentrations en NADH et NAD+ dans le mélange sachant que:
K NAD+ (à 340 nm) = 0 M-1cm-1
K NAD+ (à 260 nm) = 15 400 M-1cm-1


Réponses
Réponse à l'exercice 1 (Spectrophotometrie) Revenir à Exercice 1

- La relation entre l'absorbance ou densité optique (DO) d'une solution et sa concentration (c) est donnée par l'equation de Beer-Lambert :DO = Kcl, avec:
K = coefficient d'extinction molaire (unites : M-1 x cm-1)
c = concentration (unité : mol/l = M)
l = trajet optique (épaisseur de la cuve; unité : cm)
Selon les données, on aura:
0,70 = 1420 l mol-1 cm-1 x c x 1 cm
Donc: c = 5 x 10-4 M

- La DO d'une concentration en Lys égale à 0,35 mM:
Equation de Beer-Lambert: DO = Kcl
Ainsi : DO = 1420 l mol-1 cm-1 x (0,35 x 10-3M) x 1cm
DO = 0,50


Réponse à l'exercice 2 (Spectrophotometrie) - Revenir à Exercice 2

En exploitant la gamme-étalon, on trace la courbe (droite passant par l'origine) standard liant la DO à la concentration connue en hémoglobine. On obtient la droite suivante:

spectrophotometrie (exercices)

Comme la concentration inconnue a une absorbance de 0,45. La projection de cette valeur de DO sur la droite a pour vaeur de concentration en hémoglobine (axe des abscisses) 9,5 µg/ml.


Réponse à l'exercice 3 (Spectrophotometrie) - Revenir à Exercice 3

a- : DO (à 340 nm) = 0,438, DO (à 260 nm) = 1,086.

b- : (NADH) = 7,073. 10 -5 M, (NAD+) = 1,432. 10 -5 M



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Spectrophotometrie (vidéo): Explication de l'absorbance ou Densité Optique (DO) des molécules et Suivi de la méthode de dosage par spectrophotometrie.



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