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Gène et bases du génie génétique
Le génie
génétique qui conduit aux transformations génétiques
s'opérant sur l'ADN, s'appuie sur un ensemble d'outils cellulaires
et moléculaires dont le clonage d'un gène
LIENS UTILES.
Voie Gène ---> Protéine
Après
isolement d'un gène précis dans une banque de cADN ou
une banque génomique on procède à son séquençage
et son analyse. La détermination des séquences
de nucléotides se fait par les techniques de Maxam et Gilbert
ou de Sanger.
Après
séquençage, on réalise la synthèse d'un
oligopeptide correspondant à une partie de la séquence
codante du gène. Cette opération est rendue possible grâce
à des appareils pouvant synthétiser des oligopeptides
d'environ 30 acides aminés (visualisation
des acides aminés). Pour analyser le produit (gène),
on procède à la purification de la protéine
par chromatographie
d'affinité en utilisant un anticorps monoclonal préparé
contre l'oligopeptide préalablement synthétisé
( voir schéma récapitulatif ci dessous).

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Voie Protéine
---> Gène
Cette fois, la protéine est purifiée. Néanmoins, son gène reste inconnu. La protéine sera analysée
par électrophorèse bidimensionnelle. Seuls qeulques nanogrammes de la protéine
peuvent être élués du gel ayant servi de support d'électrophorèse. La protéine isolée
peut être séquencée grâce à des
appareils automatiques pouvant analyser jusqu'à 10 picomoles
de protéines. La séquence obtenue peut être comparée
à d'autres séquences des banques de données d'oligopéptides.
Les séquences oligonucléotidiques correspondantes
seront déterminées. Aussi, le mélange d'oligonucléotides
déduit peut être fabriqué à l'aide de machines
automatiques. Les différents oligonucléotides sont utilisés
comme sondes moléculaires pour rechercher les séquences
complémentaires dans une banque de clones de cADN ou de clones
génomiques ( voir schéma récapitulatif ci dessous).
Outils cellulaires et moléculaire du
génie génétique
Le
génie génétique utilise des outils cellulaires
et moléculaire.
1/
Outils cellulaires.
L'isolement
et l'amplification d'un gène impose son clonage et sa
multiplication dans des cellules de procaryotes (bactéries)
ou d'eucaryotes pouvant être mises en culture in vitro.
Ces cellules peuvent être réimplantées dans un embryon
ou un organisme entier. Aussi, le ADN peut être injecté
dans un oeuf qui donnera un nouvel animal une fois réimplanté
dans un individu femelle. De façon générale, l'isolement
et l'amplification d'un gène se réalisent souvent dans
une bactérie.
2/
Vecteurs.
Le
transfert des gènes vers d'autres organismes nécessite
un vecteur capable de se transferer dans une cellule cible et
de s'autorépliquer. Les vecteurs sont des fragments de ADN contenant
une origine de réplication (ori, réplicon). Ils peuvent
correspondre à:
1/
Episomes ou Plasmides spécifiques des bactéries (voir
Animation).
2/ Episomes ou virus à ADN des cellules eucaryotes.
3/ Virus à ARN pouvant s'intégrer sous l'état de
ADN proviral dans le ADN des cellules eucaryotes.
4/ Bactériophages (virus des bactéries) se multipliant
dans les bactéries.
Le
rôle d'un vecteur réside dans:
-
conservation d'une séquence d'ADN donnée
- Multiplication dun fragment dADN en grand nombre de copies
- Modification pour y introduire des mutations, délétions
- Capacité de réintroduction dans des cellules.
Il
existe plusieurs types de vecteurs dont des vecteurs d'expression
(vecteurs spécialisés) où on peut exploiter leurs
promoteurs pour exprimer un gène cloné (bien qu'il
soit possible d'exprimer ce gène sous le contrôle de son
propre promoteur). Les promoteurs portés par les vecteurs d'expression
ont été optimisés pour la fixation de l'ARN polymérase
d'E. coli et plusieurs d'entre eux peuvent être régulés
facilement en changeant les conditions de croissance des cellules hôtes.
Vecteur
expression animation

En
plus des caractéristiques des vecteurs de clonage (origine de
réplication (ori), site de coupure par les enzymes de restriction
et repérage facile des bactéries transformées (Antio
R), les vecteurs d'expression possèdent:
- un promoteur (régulé)
- un site de terminaison de la transcription (préférable)
- un site de liaison pour le ribosome (RBS)
- un codon stop (présent sur le vecteur ou linsert)
Les
promoteurs classiquement trouvés sur les vecteurs sont:
1/ Promoteurs phagiques sur les vecteurs procaryotes :
- promoteur phage T5 : reconnu par lARN pol dE. coli.
- promoteur du phage T7 : reconnu par lARN polymérase du
phage T7
Dans ce cas, il est nécessaire dutiliser une souche dE.
coli particulière exprimant lARN polymérase
T7 (souche BL21).
2/ Promoteurs viraux sur les vecteurs eucaryotes :
- promoteur P(CMV) du cytomégalovirus reconnu par lARN
polymérase de cellules de mammifères
- promoteurs de baculovirus (cellules insectes).
3/ Autres promoteurs 'forts' reconnus par lARN polymérase
de la cellule hôte :
- promoteurs du gène AOX1 (alcool oxydase) pour Pichia pastoris.
3/
Enzymes de synthèse et de modification des acides nucléiques.
Les
enzymes de synthèse de ADN les plus utilisées sont les
enzymes de restrictiction (endonucléases) reconnaissant
une séquence de 4-6 paires de nucléotides dans l'ADN.
Ces 'enzymes-ciseaux' peuvent couper l'ADN en plusieurs fragments de
tailles différentes. Les coupures de l'ADN génèrent
des bouts collants (après coupures 'de travers') ou non (après
coupures franches). Des enzymes de synthèse d'ADN in vitro
sont impliquées dans les grandes opérations du génie
génétique. Il s'agit d'abord de la ADN polymerase
(ADN pol. I de Kornberg) qui est capable de synthétiser un ADN
bicaténaire à partir d'un ADN monocaténaire contenant
une amorce ('primer') avec une extrémité 3'OH libre. Une
deuxième enzyme; la transcriptase reverse; capable de
synthétiser du ADN à partir de l'ARN (ADN polymérase
ARN dépendante) est impliquée dans la fabrication d'un
ADN bicaténaire à partir d'un ARN. Le deuxième
brin du ADN est synthétisé simultanément avec l'élimination
de l'ARN par la ribonucléase H associée à la même
enzyme (QCM-expression
des gènes)
Les
modifications des acides nucléiques utilisées en génie
génétique sont de deux types:
-
Modifications internes à l'ADN. Ils consistent à
des méthylations par des méthylases concernant
une cytosine (C) ou une adénine (A).
- Modifications aux extrémités de l'ADN. Elles
ont pour but l'addition ou l'élimination de nucléotides
aux deux extrémités de l'ADN. La désoxynucléotidyl
transférase terminale permet la synthèse d'une 'queue'
d'oligo X aux deux extrémités 3' de l'ADN. La kinase
et la phosphatase peuvent respectivement fixer ou éliminer
un phosphate sur les deux extrémités 5' d'un ADN double
brin permettant ainsi aux deux fragments d'ADN d'être liés
ou séparés. Des ligases permettent de relier
les extrémités franches (ligases du bactériophage
T4) ou les extrémités à bouts collants (ligase
d'E.coli) résultant de l'action des enzymes de restriction
sur l'ADN.
Les
modifications des acides nucléiques rentrant dans le cadre du
génie génétique sont à l'origine de la transgénèse
(transfert de gènes).

Transformation
des bactéries
Les transformations bactériennes peuvent être réalisées
par un ADN total bactérien, un plasmide et un bactériophage.
La transfection des bactéries par un plasmide, couramment utilisée
en génie génétique, permet le transfert des gènes
portés par le plasmide (exemple de la résistances à
des antibiotiques). La transfection par bactériophage (virus bactérien)
consiste en une injection du ADN viral dans la bactérie où
il se réplique. Parfois, ce ADN s'intègre dans le ADN bactérien
sous forme de prophage. La bactérie porteuse du prophage (bactérie
lysogène) peut acquérir un nouveau caractère donné
par le bactériophage.
Transformation
des cellules eucaryotes
Les
cellules eucarotes maintenues en cultures peuvent être transformées
par 4 moyens différents; addition d'un ADN porteur d'un gène,
transfection par ADN viral, transformation par fusion cellulaire et
transfert de gènes par microinjection de ADN dans un noyau cellulaire.
La
transformation de cellules eucaryotes par du ADN consiste à
cloner en présence d'un ADN porteur d'un gène précis,
des cellules obtenues à partir de tissus permettant d'obtenir
des lignées cellulaires en culture in vitro.
La transfection de cellules eucaryotes par du ADN viral d'origine
animale ou végétale, a pour objectif l'augmentation de
l'efficacité du transfert du ADN dans les cellules. Le ADN viral
peut s'intégrer dans le ADN cellulaire sous forme de provirus
et donne à la cellule de nouveaux caractères, comme l'induction
de tumeurs.
La transformation de cellules eucaryotes par fusion cellulaire
donnant des hybridomes (cellules hybrides), est un autre moyen de transfert
de gènes d'une cellule à une autre. Après plusieurs
générations, les cellules hybrides peuvent perdre certaines
parties du génome (chromosomes,...) et donnent lieu à
des phénotypes différents où certains gènes
peuvent être localisés sur des chromosomes précis.
La transformation de cellules eucaryotes par microinjection de ADN
dans le noyau cellulaire permet le transfert de gènes qui
s'intègrent de façon stable dans le génome de cellules
maintenues en culture.
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au Clonage
d'un gène