génie génétique

Gène et bases du génie génétique

Le génie génétique qui conduit aux transformations génétiques s'opérant sur l'ADN, s'appuie sur un ensemble d'outils cellulaires et moléculaires dont le clonage d'un gène
LIENS UTILES.

Voie Gène ---> Protéine

Après isolement d'un gène précis dans une banque de cADN ou une banque génomique on procède à son séquençage et son analyse. La détermination des séquences de nucléotides se fait par les techniques de Maxam et Gilbert ou de Sanger.

Après séquençage, on réalise la synthèse d'un oligopeptide correspondant à une partie de la séquence codante du gène. Cette opération est rendue possible grâce à des appareils pouvant synthétiser des oligopeptides d'environ 30 acides aminés (visualisation des acides aminés). Pour analyser le produit (gène), on procède à la purification de la protéine par chromatographie d'affinité en utilisant un anticorps monoclonal préparé contre l'oligopeptide préalablement synthétisé ( voir schéma récapitulatif ci dessous).

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Voie Protéine ---> Gène

Cette fois, la protéine est purifiée. Néanmoins, son gène reste inconnu. La protéine sera analysée par électrophorèse bidimensionnelle. Seuls qeulques nanogrammes de la protéine peuvent être élués du gel ayant servi de support d'électrophorèse. La protéine isolée peut être séquencée grâce à des appareils automatiques pouvant analyser jusqu'à 10 picomoles de protéines. La séquence obtenue peut être comparée à d'autres séquences des banques de données d'oligopéptides. Les séquences oligonucléotidiques correspondantes seront déterminées. Aussi, le mélange d'oligonucléotides déduit peut être fabriqué à l'aide de machines automatiques. Les différents oligonucléotides sont utilisés comme sondes moléculaires pour rechercher les séquences complémentaires dans une banque de clones de cADN ou de clones génomiques ( voir schéma récapitulatif ci dessous).

Outils cellulaires et moléculaire du génie génétique

Le génie génétique utilise des outils cellulaires et moléculaire.

1/ Outils cellulaires.

L'isolement et l'amplification d'un gène impose son clonage et sa multiplication dans des cellules de procaryotes (bactéries) ou d'eucaryotes pouvant être mises en culture in vitro. Ces cellules peuvent être réimplantées dans un embryon ou un organisme entier. Aussi, le ADN peut être injecté dans un oeuf qui donnera un nouvel animal une fois réimplanté dans un individu femelle. De façon générale, l'isolement et l'amplification d'un gène se réalisent souvent dans une bactérie.

2/ Vecteurs.

Le transfert des gènes vers d'autres organismes nécessite un vecteur capable de se transferer dans une cellule cible et de s'autorépliquer. Les vecteurs sont des fragments de ADN contenant une origine de réplication (ori, réplicon). Ils peuvent correspondre à:

1/ Episomes ou Plasmides spécifiques des bactéries (voir Animation).
2/ Episomes ou virus à ADN des cellules eucaryotes.
3/ Virus à ARN pouvant s'intégrer sous l'état de ADN proviral dans le ADN des cellules eucaryotes.
4/ Bactériophages (virus des bactéries) se multipliant dans les bactéries.

Le rôle d'un vecteur réside dans:

- conservation d'une séquence d'ADN donnée
- Multiplication dun fragment d’ADN en grand nombre de copies
- Modification pour y introduire des mutations, délétions
- Capacité de réintroduction dans des cellules.

Il existe plusieurs types de vecteurs dont des vecteurs d'expression (vecteurs spécialisés) où on peut exploiter leurs promoteurs pour exprimer un gène cloné (bien qu'il soit possible d'exprimer ce gène sous le contrôle de son propre promoteur). Les promoteurs portés par les vecteurs d'expression ont été optimisés pour la fixation de l'ARN polymérase d'E. coli et plusieurs d'entre eux peuvent être régulés facilement en changeant les conditions de croissance des cellules hôtes. Vecteur expression animation

En plus des caractéristiques des vecteurs de clonage (origine de réplication (ori), site de coupure par les enzymes de restriction et repérage facile des bactéries transformées (Antio R), les vecteurs d'expression possèdent:
- un promoteur (régulé)
- un site de terminaison de la transcription (préférable)
- un site de liaison pour le ribosome (RBS)
- un codon stop (présent sur le vecteur ou l’insert)

Les promoteurs classiquement trouvés sur les vecteurs sont:
1/ Promoteurs phagiques sur les vecteurs procaryotes :
- promoteur phage T5 : reconnu par l’ARN pol d’E. coli.
- promoteur du phage T7 : reconnu par l’ARN polymérase du phage T7
Dans ce cas, il est nécessaire d’utiliser une souche d’E. coli particulière exprimant l’ARN polymérase T7 (souche BL21).
2/ Promoteurs viraux sur les vecteurs eucaryotes :
- promoteur P(CMV) du cytomégalovirus reconnu par l’ARN polymérase de cellules de mammifères
- promoteurs de baculovirus (cellules insectes).
3/ Autres promoteurs 'forts' reconnus par l’ARN polymérase de la cellule hôte :
- promoteurs du gène AOX1 (alcool oxydase) pour Pichia pastoris.

3/ Enzymes de synthèse et de modification des acides nucléiques.

Les enzymes de synthèse de ADN les plus utilisées sont les enzymes de restrictiction (endonucléases) reconnaissant une séquence de 4-6 paires de nucléotides dans l'ADN. Ces 'enzymes-ciseaux' peuvent couper l'ADN en plusieurs fragments de tailles différentes. Les coupures de l'ADN génèrent des bouts collants (après coupures 'de travers') ou non (après coupures franches). Des enzymes de synthèse d'ADN in vitro sont impliquées dans les grandes opérations du génie génétique. Il s'agit d'abord de la ADN polymerase (ADN pol. I de Kornberg) qui est capable de synthétiser un ADN bicaténaire à partir d'un ADN monocaténaire contenant une amorce ('primer') avec une extrémité 3'OH libre. Une deuxième enzyme; la transcriptase reverse; capable de synthétiser du ADN à partir de l'ARN (ADN polymérase ARN dépendante) est impliquée dans la fabrication d'un ADN bicaténaire à partir d'un ARN. Le deuxième brin du ADN est synthétisé simultanément avec l'élimination de l'ARN par la ribonucléase H associée à la même enzyme (QCM-expression des gènes)

Les modifications des acides nucléiques utilisées en génie génétique sont de deux types:

- Modifications internes à l'ADN. Ils consistent à des méthylations par des méthylases concernant une cytosine (C) ou une adénine (A).
- Modifications aux extrémités de l'ADN. Elles ont pour but l'addition ou l'élimination de nucléotides aux deux extrémités de l'ADN. La désoxynucléotidyl transférase terminale permet la synthèse d'une 'queue' d'oligo X aux deux extrémités 3' de l'ADN. La kinase et la phosphatase peuvent respectivement fixer ou éliminer un phosphate sur les deux extrémités 5' d'un ADN double brin permettant ainsi aux deux fragments d'ADN d'être liés ou séparés. Des ligases permettent de relier les extrémités franches (ligases du bactériophage T4) ou les extrémités à bouts collants (ligase d'E.coli) résultant de l'action des enzymes de restriction sur l'ADN.

Les modifications des acides nucléiques rentrant dans le cadre du génie génétique sont à l'origine de la transgénèse (transfert de gènes).

Transformation des cellules eucaryotes

Les cellules eucarotes maintenues en cultures peuvent être transformées par 4 moyens différents; addition d'un ADN porteur d'un gène, transfection par ADN viral, transformation par fusion cellulaire et transfert de gènes par microinjection de ADN dans un noyau cellulaire.

La transformation de cellules eucaryotes par du ADN consiste à cloner en présence d'un ADN porteur d'un gène précis, des cellules obtenues à partir de tissus permettant d'obtenir des lignées cellulaires en culture in vitro.
La transfection de cellules eucaryotes par du ADN viral d'origine animale ou végétale, a pour objectif l'augmentation de l'efficacité du transfert du ADN dans les cellules. Le ADN viral peut s'intégrer dans le ADN cellulaire sous forme de provirus et donne à la cellule de nouveaux caractères, comme l'induction de tumeurs.
La transformation de cellules eucaryotes par fusion cellulaire donnant des hybridomes (cellules hybrides), est un autre moyen de transfert de gènes d'une cellule à une autre. Après plusieurs générations, les cellules hybrides peuvent perdre certaines parties du génome (chromosomes,...) et donnent lieu à des phénotypes différents où certains gènes peuvent être localisés sur des chromosomes précis.
La transformation de cellules eucaryotes par microinjection de ADN dans le noyau cellulaire permet le transfert de gènes qui s'intègrent de façon stable dans le génome de cellules maintenues en culture.