Les protéines (بروتينات) sont constituées de séquences d'acides aminés (structure primaire). Les structures tertiaire et quaternaire leur confèrent une fonction biologique définie comme la catalyse enzymatique. Le séquençage des protéines implique l'utilisation d'enzymes comme la trypsine et la chymotrypsine.
QUESTION 1. Parmi les produits suivants, lesquels ne sont pas utilisés pour identifier le résidu N-terminal d'une protéine ?. (cocher la réponse juste) (Bromure de cyanogène et Acide performique.)(!Fluorodinitrobenzene.)(!Phenyl isothiocyanate.)(!Chlorure de dansyle.)
QUESTION 2. Parmi les propositions suivantes concernant la dégradation d'Edman, laquelle est fausse ? (cocher la réponse juste). (!le Phényl isothiocyanate est couplé au résidu N-terminal.)(!Dans des conditions acides modérées, le peptide modifié est clivé en un dérivé cyclique de l'acide aminé terminal et un peptide raccourci -moins le 1er. AA-.)(!Si une protéine possède un résidu N-terminal bloqué -comme celui formé par la Formyl méthionine-, elle ne peut réagir avec le Phényl isothiocyanate.)(le Phényl isothiocyanate est couplé au résidu C-terminal.)
QUESTION 3. En voulant séquencer une protéine, on essaie de générer des peptides qui se chevauchent en utilisant des clivages en des sites spécifiques. Parmi les propositions suivantes, quelle est celle qui est fausse (cocher la réponse juste). (Le Bromure de cyanogène clive sur le côté carboxylique de la thréonine alos que la chymotripsine coupe sur le côté carboxylique de l'aspartate et du glutamate.)(!la trypsine clive sur le côté carboxylique de la lysine et de l'arginine.)(!la chymotrypsine clive sur le côté carboxylique des acides aminés aromatiques et de ceux ayant une chaîne latérale encombrante.)(!le 2-nitro-5-thiocyanobenzoate clive sur le côté aminé des résidus de la cysteine)
Réponses brèves
Q1: LE BROMURE DE CYANOGENE COUPE DU COTE C-TERMINAL. L'ACIDE PERFORMIQUE OXYDE LES PONTS -S-S- ET TRANSFORME LA CYSTEINE ET LA CYSTINE EN ACIDE CYSTEIQUE
Q2: L'ISOTHIOCYANATE DE PHENYLE (PITC = REACTIF D'EDMANN) REAGIT AVEC L'EXTREMITE N-TERMINALE
Q3 : LE BROMURE DE CYANOGENE COUPE DU COTE C-TERMINAL DE LA METHIONINE. LA CHYMOTRYPSINE COUPE DU COTE C-TERMINAL LES ACIDES AMINES AROMATIQUES (Phe, Trp et Tyr).
Exercice sur la structure des protéines
Soit le fragment d'hémoglobine suivant:
Val-Leu-Ser-Pro-Ala-Lys-Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Ala-Trp-Gly-Lys-Val-Gly-Ala-His-Ala-Gly-Glu-Tyr-Gly-Ala-Glu-Ala-Thr-Glu. Quels traitements doit-on utiliser pour déterminer le résidu N-terminal et pour obtenir 2 ensembles de peptides qui se chevauchent de façon à compléter la séquence en acides aminés ? Donner la séquence des peptides obtenus.
Réponse brève
Avertissement: Les éléments d'information ci joints ne peuvent constituer les réponses complètes aux questions posées, considérant d'éventuels manques de précisions que le responsable de l'épreuve pourrait fournir suite à la demande des étudiants.
Le résidu N-terminal du fragment d'hémoglobine peut être déterminé par marquage avec du Fluorodinitrobenzene
ou du Chlorure de dansyle ou en analysant le fragment intact par la méthode
de dégradation d'Edman. Ceci montre que le résidu
N-terminal esy Val. La digestion par la trypsine, la séparation
des peptides et la dégradation d'Edman donnent:
Val-Leu-Ser-Pro-Ala-Lys, Thr-Asn-Val-Lys, Ala-Ala-Trp-Gly-Lys, Val-Gly-Ala-His-Ala-Gly-Glu-Tyr-Gly-Ala-Glu-Ala-Thr-Glu.
La digestion par la chymotripsine, la séparation des peptides et la dégradation d'Edman donnent:
Val-Leu-Ser-Pro-Ala-Lys-Thr-Asn-val-Lys-Ala-Ala-Trp, Gly-Lys-Val-Gly-Ala-His-Ala-Gly-Glu-Tyr, Gly-Ala-Glu-Ala-Thr-Glu.
Examen. Protéines(FSSM, Janvier 1996, BG2)
QUESTION 1
Soit un oligopeptide H. On le soumet aux traitements suivants :
La carboxypeptidase A ne donne aucun résultat.
2. Le PTC libère successivement VAL puis TYR.
3. La trypsine n'a aucune action apparente.
4. La chymotrypsine libère un tétrapeptide A, un dipeptide B et TRP.
a. A traité par l'hydrazine révèle une LYS non modifiée.
b. Le traitement par l'aminopeptidase détache GLU.
c. Le CNBr libère 2 dipeptides qui migrent dans des directions opposées une fois soumis à l'électrophorèse à pH 7,0.
d. L'un de ces 2 dipeptides traité par le DNFB suivi d'hydrolyse acide forte montre la présence de 2 DNP-AA, dont le DNP-VAL.
e. Le traitement de B par la fluorescamine suivi d'hydrolyse acide donne VAL fluorescent sous lumière UV.
f. La carboxypeptidases A libère TYR.
Quelle est la séquence de A ? Peut-on en déduire sa position dans H ?
Quelle est la séquence de B ?
5. En déduire la séquence de H. La vérifier.
QUESTION 2.
On veut déterminer quelques caractéristiques physico-chimiques de 2 protéines A et B.
1. Soumise à une chromatographie d'exclusion, la protéine A montre une MM apparente de 160000. Par contre, elle ne montre qu'une bande unique de MM égale à 40000, une fois soumise à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. Par ailleurs, la protéine A migre franchement vers l'anode lors de l'électrophorèse à pH 7,0. Quelle(s) conclusion(s) peut-on avoir sur la structure de A ?
2. La protéine B co1% de TRP. La chromatographie d'exclusion permet son élution entre 2 protéines de MM respectives 35800 et 42000. La même expérience effectuée avec un traitement préalable à la guanidin6 M montre que B est éluée après ces 2 protéines. Enfin, l'électrophorèse à pH 7,0, révèle une faible migration sur gel de polyacrylamide. Quelle(s) conclusion(s) peut-on avoir sur la structure de B ?
3. Quel sera l'ordre d'élution des 2 protéines A et B lors d'une chromatographie échangeuse d'anions ? Préciser le pH initial du tampon.
4. Les protéines A et B sont soumisesà une chromatographie d'exclusion en présence de 5 autres protéines monomériques C, D, E, F et G de MM respectives 200000, 125000, 96000, 64000 et 35800. Sachant que la limite d'exclusion du gel utilisé est de 110000, préciser l'ordre d'élution des différentes protéines.
5. Quel résultat obtient-on lorsque l'expérience précédente est réalisée avec un traitement préalable à l'urée 8 M de l'ensemble des protéines ? (MM du TRP égale à 181).
LIENS UTILES
- Biochimie structurale (Contrôle final QCM corrigé, S3 (archives 2024)
- Contrôle sur les protéines (S3)
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