Acides nucléiques (ADN, ARN). TP

ACIDES NUCLEIQUES - ADN, ARN - QUANTIFICATION PAR SPECTROPHOTOMETRIE

Pour quantifier les acides nucléiques comme l'ADN -DNA- et l'ARN - RNA-, Il est nécessaire de commencer par leur purification. Les résultats obtenus souvent par spectrophotométrie, sont tributaires du degré de pureté des acides nucléiques, l'ADN, en particulier (présences de traces de protéines, ARN, autres composés).

L'absorption de la lumière dans l'ultra-violet par les acides nucléiques dépend aussi de leur structure -double brin, simple brin- et de l'état de dégradation -hydrolyse-. Ainsi, l'absorbance -densité optique, DO- d'une solution d'acides nucléiques à 260 nm égale à 1 correspond à des concentrations de 50 µg/mL et 37 µg/mL l'ADN double brin - bicaténaire- et l'ADN simple brin -monocaténaire-, respectivement. Elle correspond à une concentration égale à 40 µg/mL pour l'ARN -simple brin-

QUESTION 1. Choisir parmi les successions de structures d'ADN citées ci dessous, celle qui correspond aux densités optiques à 260 nm égales à 0,38 et 0,61, respectivement?- cocher la réponse juste - (!ADN simple brin - ADN double brin.)(ADN double brin - ADN simple brin.)

QUESTION 2. Lélectrophorèse est souvent utilisée pour tester la pureté de l'ADN préalablement extrait et purifié selon un protocole déterminé. L'exemple suivant (figure ci-dessous) le démontre. L'ADN de plantes (A, B, C, D) purifié suivant un protocole précis a été soumis à une hydrolyse par HindIII en présence ou en absence de la RNase puis séparé par éléctrophorèse sur gel d'agarose 0,8%. Sur l'électrophorégramme suivant, où se trouve l'ARN? - cocher la réponse juste - (Bande intense et diffuse en bas du gel pour les extraits d'ADN non hydrolysés par RNase)(!Bande intense en haut du gel pour les extraits d'ADN hydrolysés par RNase)(!Bande intense en haut du gel pour les extraits d'ADN non hydrolysés par RNase)

Pour suivre les explications relatives à l'absorbance des acides nucléiques, faire les TDs du genre: Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques.
Pour étudier les propriétés physico-chimiques des acides nucléiques, vous devez d'abord les purifier. Ceci est l'objet de séances de travaux pratiques, comme le TP du semestre S3.
Dans un niveau supérieur - exemple semestre S5-, la purification de l'ADN est destinée essentiellement à des études qualitatives où l'électrophorèse de l'ADN devient plus importante.
Un ADN purifié selon un protocole donné, peut contenir encore des traces de protéines, ARN , polysaccharides, phénols, ..

Dans le but d'évaluer par spectrophotométrie l'ADN de plantes, celui ci est d'abord purifié suivant le protocole shématisé dessous, est soumis aux trois traitements:
- Traitement A donnant ADN A: 50 µL de l'extrait d'ADN purifié dilué avec l'eau pour avoir un volume total de 2 mL.
- Traitement B donnant ADN B: 50 µL d'ADN purifié + 5 µL de RNase. L'hydrolysat est complété avec de l'eau à 2 mL.
- Traitement C donnant ADN C - ADN amputédes XMP-: 50 µL d'ADN purifié + 5 µL de RNase. L'hydrolysat est complété avec de l'eau à 2 mL. Les XMP libres de l'hydrolysat -ARN- sont précipités à -20°C par 150 µL d'éthanol et 15 µL d'cétate de Na. Après centrifugation, le culot est récupéré et solubilisé dans l'eau. repris dans l'eau et complété à 2mL par l'eau distillée.

- Traitement D donnant ADN D -ADN amputé des XMP et dénaturé avec la température -: 50 µL d'ADN purifié + 5 µL de RNase. L'hydrolysat est complété avec de l'eau à 2 mL. Les XMP de l'hydrolysat sont éliminés comme pour le traitement C. Le DNA est en suite dénaturé 5 min à 100°C, repris dans l'eau et complété à 2mL par l'eau distillée.

QUESTION 1. A votre avis quel est l'ADN (A, B, C, D) qui doit présenter un pic d'absorption à 260 le plus faible?- cocher la réponse juste - (!ADN A)(!ADN B)(ADN C)(!ADN D)

Le protocole de purification de l'ADN de plantes appliqué pour avoir l'extrait d'ADN plus ou moins purifié est résumé dans la figure ci dessous.

ADN, ARN. SPECTRE D'ABSORPTION DE LA LUMIERE EN RELATION AVEC LA STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES

Spectres d'absorption des ADN A, B, C et D.

Pour avoir une idée sur les spectres d'absorption de l'ADN ayant subi les différents traitements, peut être obtenue selon la figure ci dessous.

AIDE A L'INTERPRETATION:
ADN A = ADN + ARN
ADN B = ADN + ARN hydrolysé
ADN C = ADN seul (ARN hydrolysé et éliminé)
ADN D = ADN dénaturé par chauffage à 100°C (ADN monocaténaire)

Quelques données de spectrophotométrie:

Coefficient d'extinction des acides nucléiques à 260 nm:
- ADN double brin: 0,020 (µg/mL)^-1 cm^-1
- ADN simple brin: 0,027 (µg/mL)^-1 cm^-1
- ARN -simple brin-: 0,025 (µg/mL)^-1 cm^-1

Concentrations en acides nucléiques à 260 nm correspondantes à DO = 1:
- ADN double brin: 50 µg/mL.
- ADN simple brin: 37 µg/mL
- ARN simple brin: 40 µg/mL

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