Techniques de séparation basées sur l'ionicité des molécules. Chromatographie d'échange d'ions (ion exchange chromatography, كروماتوغرافيا التبادل الإيوني)

Chromatographie échange ions (ion exchange chromatography, كروماتوغرافيا التبادل الإيوني)

Le critère de l'ionicité des molécules donne lieu aux techniques de chromatographie échange ions (ion exchange chromatography, كروماتوغرافيا التبادل الإيوني
La chromatographie d'échange d'ions sépare les protéines en fonction de leur charge de surface nette, grâce à des interactions électrostatiques qui se produisent entre les protéines et une phase stationnaire chargée.
Deux types de chromatographie d'échange d'ions sont à distinguer:
- Chromatographie d'échange d'anions (phase stationnaire chargée positivement qui se lie à des protéines chargées négativement).

- Chromatographie d'échange de cations (phase stationnaire chargée négativement qui se lie à des protéines chargées positivement).

La chromatographie d'échange d'ions est souvent utilisée comme une étape intermédiaire dans un protocole de purification des protéines. Cependant, elle peut donner une résolution élevée pour certaines protéines lorsqu'elle est utilisée plus tôt ou plus tard au cours de la purification.
Tout dépend du pH du tampon et du pI des molécules à séparer!
L'échange ionique est en rapport avec la charge électrique nette des protéines et qui dépend de leurs compositions en acides aminés. La charge nette d'une protéine est influencée par le pH du solvant (tampon) dans lequel elle est dissoute (échange des ions d'hydrogène avec les protéines). Le point isoélectrique (pI) d'une protéine est le pH auquel la protéine a une charge globale nette égale à zéro. A un pH supérieur au pI, une protéine aura une charge nette négative. Un pH inférieur au pI rend la protéines chargée positivent (assez de H+). Ainsi, le pH du solvant peut être ajusté afin de faciliter la liaison des prorotéines aux résines échangeuses d'ions ou de promouvoir leur élution une fois liées.
La connaissance préalable du point isoélectrique d'une protéine peut aider à déterminer le type de chromatographie échangeuse d'ions le plus approprié. Le calcul du pI théorique d'une protéines est basé entièrement sur sa séquence d'acides aminés. Il ne prend pas en compte la structure tridimensionnelle de la protéine. Dans son état naturel, certains résidus d'acides aminés d'une protéine sont plus exposés que d'autres. Il en résulte une différence entre le pI calculé théoriquement et le pI réel et la charge électrique réelle de surface de la protéine. De même, la distribution des acides aminés les uns par rapport aux autres peut affecter le pI d'une protéine (ceci n'est pas pris en considération lors des calculs théoriques de pI). Certaines techniques comme l'isoélectrofocalisation permettent la détermination expérimentale du pI d'une protéine à l'état natif.
En règle générale, Un pH de tampon (solvant) qui est d'environ à une unité de pH loin du pI est suffisant pour la liaison d'une protéine en chromatographie d'échange d'ions. Cependant, dans certains cas, un pH du tampon plus éloigné du pI devient nécessaire.
Quatre groupes fonctionnels chargés sont plus couramment utilisés dans la chromatographie d'échange d'ions. Ils sont classés en 'échangeurs d'anions' er 'échangeurs de cations'.

Echangeurs d'anions (phase stationnaire chargée positivement)
Exemples:
- Ammonium quaternaire (Q) - échangeur d'anions fort
- Diéthylaminoéthyle (DEAE) - échangeur d'anions faible
La chromatographie d'échange d'anions DEAE-cellulose ne doit pas être utilisée à des pH supérieurs à pH 8,5. Le groupe diéthylamino (-CH2-CH2-NH+-CH2-CH3) du DEAE-cellulose porte une charge positive qui est à la base du fonctionnement de cette colonne. En effet, les acides aminés/protéines chargées négativement vont se lier (via des liaisons électrostatiques) au groupe diéthylamino (molécules retenues), alors que les acides aminés/protéines chargés positivement se retrouveront dans l'éluant (molécules non retenues).Comme le groupe diéthylamino possède un pKa voisin de 8,5, ce groupe sera déprotoné à un pH supérieur à 8,5, ce qui lui enlève toute sa capacité à lier des substances chargées négativement..

Echangeurs de cations (phase stationnaire chargée négativement)

Exemples:
- Méthyl sulfonate de (S) - échangeur de cations fort
- Carboxyméthyl (CM), - échangeur de cations faible

Les échangeurs faibles (fournissant moins de rétention pour certaines protéines, ce qui permet leur élution à une force ionique plus faible) sont plus appropriés pour des protéines qui ne nécessitent pas un pH extrême pour la liaison et ainsi on peut éviter l'impact d'une force ionique élevée sur la stabilité des protéines, lors de l'élution.
Dans la chromatographie d'échange d'ions, la phase stationnaire (colonne) est d'abord équilibrée avec un tampon à force ionique faible. L'échantillon de protéines est ensuite chargé sur la colonne dans le même tampon de faible force ionique utilisé pour l'équilibrage de la colonne. La protéine liée est lavée abondamment (lavage) avant l'élution avec un tampon de force ionique plus élevée ou, dans certains cas, un tampon avec un pH modifié. Néanmoins, on peut peut ajuster le pH du tampon de façon à ce que la protéine d'intérêt ne se lie pas à l'échangeur d'ions tandis que les protéines contaminantes le font. Dans ce cas, la protéine d'intérêt n'est pas retenue (elle est recueillie dans la phase d'écoulement de la colonne), alors que les protéines contaminantes, retenues sur la colonne, sont éliminées.