CHROMATOGRAPHIE

Techniques de séparation et d'analyse. Chromatographie

Le terme 'chromatographie' ('chromatography', en anglais, كروماتوغرافيا ) vient du Grec 'Khrôma' = couleur et 'Graphein' = écrire) implique une serie de techniques reliées par un principe commun: la migration différentielle des substances à séparer à travers une phase solide poreuse (phase fixe), sous l'impulsion d'un fluides vecteur (phase mobile). Plusieurs variantes de cette technique peuvent se présenter.

Le support fixe joue un rôle primordial dans la chromatographie d'adsorption. Chaque composé du mélange à séparer migre plus ou moins vite à travers le support fixe relativement polaire (adsorbant). Il s'accumule dans une zone délimitée. Les composés peuvent être identifiés par leurs positions et leurs couleurs. Ensuite, ils peuvent être élués séparement. Les composés se séparent selon leur affinité pour la phase fixe suivant un mécanisme d'adsorption-désorption. L'oxyde d'aluminium est l'adsorbant le plus utilisé. Il est généralement contenu dans des tubes de verre disposés verticalement.

La chromatographie sur papier appartient aux chromatographies de partages. Elle est apparue vers 1944. Elle exploite le critère le critère de polarité. ---> Voir détail sur TP chromatgraphie sur papier.

Exemple 1: séparation d'un mélage d'acides aminés. Dans une phase mobile constituée par un mélange de n-butanol-acide acétique-eau (3:3:1), les acides aminés peuvent être séparés dans l'ordre croissant de leur Rf. Par exemple: l'ordre: CYS, ARG, SER, GLU, ALA, TYR, MET et LEU. La révélation des des acides aminés sur papier est effectuée par pulvérisation de la ninhydrine sur le papier séché (jaune orangé).

Exemple 2: séparation des pigments d'une feuille chlorophilienne.La séparation d'un extrait de feuilles chlorophyliennes préparé dans l'ether permet de visualiser dans l'ordre croissant de Rf, les pigments: chlorophylle b (vert), chlorophylle a (bleu-vert), xanthophylles (jaune clair) et carotènes

Vidéo: chromatographie sur papier des acides aminés:

La première séparation (monodimensionnelle) est souvent améliorée par une deuxième chromatographie où le papier séché résultant de la première séparation est tourné de 90°C puis soumis à deuxième séparation en utilisant une autre phase mobile différente de la première.

La chromatographie sur couche mince appartient aux chromatographies de partage. Elle est apparue vers 1938. Etant une technique de haute sensibilité, elle est indiquée pour la micro-analyse d'extraits de faible volumes. Un faible volume d'extrait est déposé sur une plaque chromatographique dont la partie inférieure est immergée dans un solvant. Celui ci monte par capillarité le long de la plaque et entraine les composés de l'extrait à des vitesses différentes.

Voir TP S3 sur la chromatographie sur couche mince

Vidéo: chromatographie sur couche mince des lipides:

Appelée aussi 'chromatographie de perméation' ou 'tamisage moléculaire' ou encore 'filtration sur gel', la chromatographie d'exclusion est basée sur le principe de rétention par un gel des molécules de petites tailles, se trouvant ainsi freinées dans leur parcours, par rapport aux molécules de grandes tailles qui, ne pouvant rentrer dans les mailles du gel sont éluées les premières.

تعتمد كروماتوغرافيا الإقصاء خاصية الحجم (الوزن) في عزل الجزيئات

في حالة العزل حسب حجم (وزن) الجزيئات كروماتوغرافية التغلغل أو الاقصاء، (chromatographie d’exclusion) ، تستعمل حبيبات (Sephadex) مصنعة من الكليكوز.

تعطي حبيبات (Sephadex) فتحات بقطر معين، تدخلها في العمق الجزيئات ذات الحجم المناسب إذ يتأخر خروجها النهائي من العمود، بينما تخرج في المرتبة الأولى الجزيئات كبيرة الحجم، نظرا لعدم دخولها عمق حبيبات Sephadex (أنظر الرسم). أماالجزيئات صغيرة الحجم فيتأخر خروجها من العمود الكروماتوغرافي وتسقط في الأنابيب الأخيرة

المزيد في كتاب علوم الحياة. بروتينات و أنزيمات، بعزيز 2013

chromatographie d'exclusion ou perméation (gel exclusion chromatography, كروماتوغرافيا الإقصاء، كروماتوغرافيا التغلغل

La matrice insoluble porte des charges ioniques qui retiennent les molécules de charges opposées. Les matrices généralement utilisées pour séparer des protéines sont le DiEthylAminoEthyl Cellulose (DEAE-Cellulose) qui est chargé positivement (+) et la CarboxyMéthyl Cellulose (CM-Cellulose) et la Phosphocellulose qui sont chargées négativement (-) (séparation selon le critère de l'ionicité des molécules). Le premier cas donne lieu à une chromatographie échangeuses d'anions. Le second cas correspond à une chromatographie échangeuse de cations.

La force d'association entre les molécules chargées et la matrice dépend de la force ionique et du pH de la solution d'élution.. Ionisation des acides aminé et chromatographie. Exercice, Purification des protéines. Exercices.

Le passage sur la colonne d'une solution éluante, plus chargée que la résine entre en compétition avec la résine. Ceci permet de décrocher les éléments fixés.

Ainsi, pour la chromatographie des acides aminés, ceux ci seront séparés en fonction de leur charge électrique. Les élués (non fixés à la colonne) seront ceux de même charge que la résine. Tandis que ceux de charge opposée seront fixés. Plus l’acide aminé a un pHi éloigné du pH du milieu, plus il sera acide ou basique par rapport à celui-ci, donc d’autant plus chargé. Il sera le premier à être élué ou fixé, s'il est ou n’est pas de même charge que la résine, respectivement.

Détail: Chromatographie d'échange d'ions (ion exchange chromatography, كروماتوغرافيا التبادل الإيوني)

Chromatographie d'interaction hydrophobe

C'est le type de chromatographie qui exploite comme crière de séparation la forme des molécules, derrière une affinité naturelle existant entre deux corps comme celle liant un antigène à un anticorps ou une enzyme à un inhibiteur,...

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