Peroxydase, Travail Pratique. Cinétique et détermination du mécanisme de catalyse

Peroxydase. Introduction

La peroxydase est une enzymes qui catalyse l'oxydation de molécules donneurs de protons H+ (comme les composés phénoliques des plantes) en présence du peroxyde d'hydrogène (eau oxygénée, H₂O₂) qui sera réduit en molécules d'eau (H₂O).
L'étude de lacinétique d'une peroxydase (objet du travail pratique, TP) permet de déterminer le mécanisme de catalyse de cette réaction d'oxydoréduction complexe.
La deuxième partie du TP sera consacrée à l'étude de la structure 3D de la peroxydase du raifort .
Liens utiles:
- Vidéo test d'activité de la peroxydase
- Intérrogation (début TP)
- Compte rendu TP peroxydases

Partie 1. Cinétique, détermination du mécanisme de catalyse des peroxydases et analyse des isoperoxydases par électrophorèse

1. Introduction générale

Les peroxydases sont des oxydoréductases qui catalysent l'oxydation d'un substrat (donneur de protons) en presence du peroxyde d'hydrogène (H₂O₂). La réaction globale est du type :
2 AH2 + H₂O₂ --------> 2 H₂O + 2 AH.

Les radicaux libres formés (AH.) sont très réactifs et peuvent aboutir à la formation de polymères :
2 AH. A + AH2 (ou AH-AH)

Test de l'activité enzymatique de la peroxydase

En utilisant le gaiacol comme substrat (donneur de proton H+), la réaction donne naissance au tétragaiacol, composé rouge rouille (absorbant la lumière à 470 nm, environ.

Aussi, l'o-dianisidine peut être utilisée comme substrat synthétique de la peroxydase

Les peroxydases sont des hémoprotéines contenant une composante glucidique. Leur groupement prosthétique est constitué par la protohématine IX qui est une porphyrine (4 noyaux pyrrols en cercle) liée à un atome de fer sous forme ferrique.
Le fer peut contracter 2 autres liaisons (6 au total); une qui le lie à l'azote d'une histidine au niveau de la partie protéique et une autre liaison qui le lie à l'oxygène, lequel peut faire partie d'une molécule d'eau, d'une molécule d'oxygène, d'un peroxyde, etc.
Le noyau pyrrol est un hétérocycle pentagonal. Les multiples doubles liaisons du groupement tetrapyrrolique sont conjuguées, ce qui explique le pouvoir d'absorption de la lumière par la porphyrine. Ainsi, les protéines à porphyrines sont appelées chromoprotéines et sont toutes colorées en rouge (peroxydases, hémoglobines, cytochromes). Elles absorbent certaines radiations du spectre solaire dont une étroite bande dans le proche ultraviolet (bande de soret). La spécificité de leurs spectres d'absorption est en rapport avec la structure moléculaire du groupement prosthétique. L'étude spectroscopique permet de les déceler, même à l'état de traces ou de distinguer des molécules très voisines.
Dans le domaine des applications, les peroxydases peuvent être utilisées dans plusieurs finalités dont les traitement des eaux usées. En effet, elles permettent d'éliminer les phénols (polluants toxiques) en catalysant leur polymérisation (composés moins toxiques).
Les peroxydases purifiées à partir de nombreuses plantes sont constituées par une seule chaîne polypeptidique. Elles ont des poids moléculaires de 30000 à 50000. On peut les trouver dans un même tissu sous forme de nombreuses isoenzymes qu'il est facile de séparer et de purifier par électrophorèse en conditions non dénaturantes et par chromatographie d'échange d'ions.

Principaux types de mécanismes de catalyse des réactions enzymatiques à 2 substrats.

Les mécanismes de catalyse des réactions enzymatiques à 2 substrats sont de deux grands types :
- Les mécanismes où l'ordre de fixation des substrats (S) et de libération des produits (P) ne compte plus. Ils sont appelés mécanismes au hasard (ou aléatoires).
- Les mécanismes où l'ordre de fixation des substrats et de libération des produits est obligatoire. Ce sont des mécanismes ordonnés ou séquencés.
- Les mécanismes n'impliquant pas de complexes ternaires et forment une enzyme transitoire: mécanismes ping-pong.
La cinétique enzymatique reste un moyen nécessaire mais non suffisant, pour identifier les mécanismes de catalyse. L'expérimentateur fait souvent recours aux modes d'inhibition exercée par les analogues structuraux de l'un des substrats vis à vis des autres substrats ou les types d'inhibition manifestés par les produits de la réaction vis à vis des différents substrats.

Les folioles du palmier dattier sont récupérées, lavées, numérotées et gardées au froid

3. Extraction et dosage des peroxydases

Prélever 5 g de tiges (partie entre la feuille et les racines) à partir des jeunes plants de blé ou d'orge (selon les groupes). Après rinçage avec l'eau distillée, broyer le matériel végétal dans un mortier maintenu dans la glace, en présence de 30 ml de tampon d'extraction :
- Acétate-acide acétique (pH 5,0) ......... 10 mM
- MgCl2 ………….............. 2 mM
- 2 mercaptoéthanol ……. 2 mM
- PVPP …………………. 5% (P/P)
Le 2 mercaptoéthanol empêche partiellement l'oxydation des phénols en quinones qui peuvent provoquer l'inactivation des enzymes.
Le PVPP, utilisé en milieu acide, adsorbe les composés phénoliques susceptibles d'entraîner l'inactivation des peroxydases.
L'homogénat obtenu est transvasé dans un tube de centrifugation (pour rotor Sorvall SS34) puis centrifugé 10 min à 10000 g. Après centrifugation, le surnageant (extrait brut) est récupéré dans une éprouvette de 100 ml. On note son volume final et on en prélève un volume de 1,5 ml qui servira dans les analyses suivantes.

Fractionnement par le sulfate d'ammonium.

Les protéines de l'extrait brut sont précipitées progressivement à froid, par le sulfate d'ammonium jusqu'à l'obtention d'un taux de saturation de 80% (51,6 g/100 ml). Après 2 heures et 30 min de précipitation à 0°C-4°C (glace) sous agitation lente, l'extrait est centrifugé à 10000 g pendant 10 min. Le culot obtenu est repris dans un faible volume (2 ml) de tampon acétate-acide acétique 10 mM (pH 5,0).

Chromatographie d'exclusion sur Sephadex G100.

L'extrait protéique obtenu par précipitation à 80% de saturation en sulfate d'ammonium, est filtré sur une colonne (1 cm x 15 cm) remplie de Sephadex G100. Après dépôt de l'extrait, 12 fractions de 1,5 ml sont collectées en bas de la colonne (chromatographie d'exclusion basée su le critère de la taille des molécules). Le dosage de l'activité enzymatique sera effectué sur l'ensemble des fractions. Il permet de tracer le profil d'élution des peroxydases. Les 2 fractions les plus actives du/des pic(s) seront rassemblées, séparément et conservées pour l'évaluation de la purification (rendements, taux de purification,…).

Dosage de l'activité enzymatique des peroxydases.

L'activité enzymatique est déterminée par spectrophotométrie (voir vidéo spectrophotometrie dans takween supports) en utilisant le gaiacol et le peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) comme substrats de l'enzyme.
Dans une cuve de 1 ml, déposer, dans l'ordre, 0,5 ml de tampon acétate 0,1 M (pH 5,0), 0,4 ml de gaiacol (à une concentration précisée selon le test, voir tableau ci dessous), 0,050 ml d'enzyme et 0,050 ml de H₂O₂ (à une concentration précisée selon le test) qui servira pour déclencher la réaction. Le réglage à zéro de la densité optique (DO) est réalisé après ajout de l'enzyme. Après déclenchement de la réaction par addition de H₂O₂ (concentration déterminée), la cuve, fermée à l'aide d'un papier aluminium, est agitée rapidement (par inversion dans les deux sens), puis introduite dans le spectrophotomètre, préalablement réglé sur une longueur d'onde égale à 470 nm. De suite, le temps de la réaction est suivi à l'aide d'un chronomètre. Lire la DOà 470 nm au bout de chaque minute pendant une durée de 3 minutes. Noter la variation de DO entre la la 3ième et la 2ème et minute et entre la 2ième et la 1ière minute. Une unité enzymatique correspond à la quantité de protéines donnant 0,1 unité de DO à 470 nm.
- Vidéo: test de l'activité peoxydase chez le palmier dattier :