Néoglucogenèse. Formation du glucose à partir du glucose-6-phosphate par action de la glucose-6-phosphatase (TP)
استحداث الجلوكوز

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Travail pratique sur la glucose-6-phosphatase et la néoglucogenèse chez le lapin

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VIDEO DU TP

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1. Préparation des homogénats de foie de lapin

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Matériel et réactifs

- Deux bechers de 100 ml
- Scalpel, balance, moulin électrique, éprouvette, glace en paille.
- Centrifugeuse réfrigérée (hautes vitesses), tubes de centrifugation de 50 ml.
- Tampon d'extraction constitué de Saccharose 0,25 M, Tris-HCl 5 mM (pH 6,5) et EDTA 0,1 mM.

Matériel biologique.

- Deux lapins (dont un normalement nourri et un autre mis à jeûne) desquels on enlève le foie (F) qu'on lave dans le tampon d'extraction (Saccharose 0,25 M, Tris-HCl 5mM (pH 6,5) et EDTA 0,1 mM). Peser les deux organes et découper les en petits fragments.

- Homogénéiser, séparément, les fragments de foie au moulin électrique à couteaux à raison de 100 ml de milieu d'extraction pour 10 grammes de tissus (10% (p/v)).
- Centrifuger les homogénats à l'aide d'une centrifugeuse réfrigérée pendant 10 minutes à 15000 g.
- Transférer les surnageants dans des flacons propres et conserver les dans la glace. Ils serviront comme source d'enzyme pour tester l'hydrolyse du glucose-6-phosphate (substrat exogène). Ils seront appelés 'homogénats'.

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2. Test de l'action de l'Enzyme: Hydrolyse du glucose-6-phosphate par la glucose-6-phosphatase du foie

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L'évaluation de l'activité glucose-6-phosphatase du foie est réalisée par la vitesse d'hydrolyse du substrat (glucose-6-phosphate. La réaction catalysée par la glucose-6-phosphatase est :

Glucose-6-phosphate + H2O --> Glucose + Pi

Pi ou phosphate inorganique, est l'ortho-phosphate, forme la plus simple du phosphore (PO4, souvent appelée Pi par les biologistes).
Le phosphate libéré est dosé par la méthode de Macheboeuf et Delsal.

Matériel et réactifs utiles pour le test d'activité d'hydrolyse du glucose-6-phosphate

- Bain-marie à 37°C, tubes à essai en verre, pepettes.
- Centrifugeuse de paillasse, microtubes de 2 ml
- Spectrophotomètre, cuve de mesure d'absorbance.
- Agitateur vortex.
- Homogénats (source d'enzyme) résultant de la centrifugation des homogénats de foie (FJ : foie de lapin à jeûne, FN : foie de lapin nourri).
- Tampon citrate 0,01 M pH 6,5) ;
- Glucose-6-phosphate 0,05 M préparé dans le tampon.
- EDTA (Acide éthylène diamine tétra-acétique) 0,01 M préparé dans le tampon.
- Acide trichloroacétique (TCA) 10% (p/v).

Quel est le rôle de EDTA ?. Dans le milieu réactionnel, EDTA chélate (piège) les ions Mg++ nécessaire à l'activité de la phosphatase alcaline dont l'activité peut interférer avec celle de la glucose-6-phosphatase, toutes libérant le phosphate. En effet la phosphatase alcaline est bien présente dans le foie et dans d'autres organes comme l'intestin, le rein et l'os. Elle agit sur les esters phosphoriques avec libération du phosphate minéral.

Protocole du test d'activité de la glucose-6-phosphatase du foie.

Le protocole de dosage prend en compte la présence éventuelle de phosphate préexistant dans les homogénats de foie et ne relevant pas de l'activité de la glucose-6-phosphatase. Le tableau des tests ci dessous montre la répétition des tests deux fois pour chaque type d'homogénat. Le phosphore net de la réaction correspont à la soustraction de la quantité de Pi préexistants (témoins de la réaction) de la quantité totale de Pi obtenue dans les tubes des tests de la réaction.

Après le dernier ajout de TCA 10% pour arrêter la réaction de la glucose-6 phosphatase, placer les tubes dans la glace pendant 5 minutes. Transvaser le contenu des tubes dans des microtubes de deux millilitres. Centrifuger 3 minutes et récupérer 0,5 ml de surnageant pour mesurer le phosphore libéré.

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3. Dosage du phosphore par la méthode de Macheboeuf-Delsal

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(Macheboeuf, M., and Delsal, J. Sur le dosage de très petites quantités de phosphore dans les matières organiques. Bull. Soc. Chim. Biol., 25: 116-120, 1943.)

Le phosphate minéral réagit avec le molybdate d'ammonium en solution acide (présence d'acide sulfurique) pour former un complexe, l'acide phosphomolybdique (H3PO4-[(MoO3)12).

Un agent réducteur (Sulfite de sodium +hydroquinone) réduit le molybdum du phosphomolybdate pour former un complexe phosphomolyb-2-molybdique ( H3PO4-[(MoO3)12MoO2]2) de couleur bleue, stable et soluble dans l'eau et présente un maximum d'absorbance à 690-720 nm. L'intensité de la coloration du complexe est proportionnelle à la concentration en phosphate.

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Matériel et réactifs

- Tubes à essai, pipettes, vortex, bain marie bouillant (100°C).
- Spectrophotomètre et cuves de mesure de l'absorbance.
- Surnageants des réactions d'hydrolyse du glucose-6-phosphate.
- Acide sulfurique (H2SO4) concentré.
- Molybdate d'ammonium 5% (P/V).
- Sulfite de sodium 20% (P/V).
- Solution acide d'hydroquinone 0,5%
- Solution étalon : phosphate monopotassique à 100 µg de phosphore par ml.
Manipulation:
On prépare 13 tubes à essai dont 5 tubes pour la gamme étalon et 8 tubes pour les surnageants (4 tubes témoins de la réaction et 4 tubes de test d'activité). L'acide sulfurique concentré est placé sous la hotte. Le prélèvement se fait par capillarité à laide d'une pipette plongeant dans une éprouvette.

Se rappeler de la loi de bee Lambert dans les dosages spectrophotometriques --> voir cette vidéo.

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4. Dosage des protéines dans les homogénats de foie de lapin et calcul de l'activité spécifique de la glucose-6-phosphatase

(TP. Séance 2)

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Le dosage des protéines est réalisé selon la méthode de Lowry (1951). Pour plus de détail voir la page web 'dosage des protéines pat la méthode de Lowry'.

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Le dosage des protéines est éffectué selon le tableau:

*La solution cupro-alcaline est préparée selon le mélange des réactifs suivants, pour 100 ml: 96 ml de réactif A, 2 ml de réactif B et 2 ml de réactif C
Réactif A: Na₂CO₃ à 2% dans NaOH 0,1 N.
- Réactif B: tartrate de Na et K à 2% dans l'eau.
- Réactif C : CuSO4, 5 H₂O à 1% dans l'eau

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5. Présentation des résultats et Compte-rendu (CR)

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1- Tracer les courbes des gammes étalons des dosages du phosphore et des protéines.

2- Déterminer l'activité de la glucose-6-phosphatase dans chacun des homogénats de foie. L'expression de cette activité est donnée en µg Pi/heure/ml d'homogénat, en micromoles de Pi/heure/ml d'homogénat et en µg Pi/g de foie.

3- Déterminer le nombre d'unités enzymatiques, sachant que 1 unité = libération de 1 µg de Pi/heure) par gramme de tissu frais, sachant que l'homogénat est à 10%.

4- Calculer l'activité spécifique de la glucose-6-phosphatase correspondant au foie à jeûne et au foie nourri.

5- Donner un commentaire aux résultats obtenus

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Dosage du phosphore

- Calcul du Pi de la gamme-étalon. Tube P2: 100 µg --> 1 ml, combien dans 0,3 ml?, donc dans P2 il y'a 30 µg. Même calcul pour les autres tubes.
- Tracer la gamme-étalon: DO à 690 nm = f((Pi) et projeter les DO des tubes Témoins de la réaction et des tubes tests de la réactions sur la droite puis déterminer les quantités de Pi.
- Calculer la quantité (Q) de Pi net provenant uniquement de la réaction (Pi exogène):
- Calcul de Pi libéré par la glucose-6-phosphatase de l'homogénat du foie du lapin nourri (FN):
-- (Pi)FN libéré = Pi total moyen - Pi préexistant moyen avec:
--(Pi) préexistant moyen = [(Pi)FN1 + (Pi)FN2]/2, (Pi) total moyen= [(Pi)FN1' + (Pi)FN2']/2 = QFN
Sion calcule la concentration en µg/ml, il faudra multiplier les quantités de phosphore trouvées par 2, sachant que les essais ne concernaient que 0,5 ml de surnageant.
- Calcul de Pi libéré par la glucose-6-phosphatse de l'homogénat du foie du lapin à jeûne (FJ):
(Pi)FJ libéré = Pi total moyen - Pi préexistant moyen avec:
(Pi) préexistant moyen = [(Pi)FJ1 + (Pi)FJ2]/2, (Pi) total moyen= [(Pi)FJ1' + (Pi)FJ2']/2,
- Pi net de la réaction: [(QFJ1' + QFJ2')/2] - [(QFJ1 + QFJ2)/2] = QFJ

Quantité de Pi libéré dans le milieu réactionnel (volume = 1,6 ml): à multiplier les valeurs (Pi) (exprimées en µg/ml) par 1,6. Cette quantité de Pi est libérée par 30 min. Pour calculer (Pi) par heure (60 minutes), il faut multiplier encore par 2.
-- Pour calculer la quantité de Pi libérée/h/ml d'homogénat, il faut multiplier la quantité de Pi libérée/h par 2,5, car le volume de l'homogénat utilisé dans le test de la réaction était 0,4 ml.

Expression de l'activité de la glucose-6 phosphatase en µmole de Pi/h/ml d'homogénat:
1 mole de Pi correspond à 31 g de P, soit 1 µmole correspond à 31 µg.

Calcul de la concentration des protéines dans l'homogénat du foie:
A partir de la gamme étalon SAB calculer les 3 concentrations de protéines correspondantes aux prises d'éssai 0,1 ml, 0,2 ml et 0,3 ml. Faire la moyenne. Comme on a dosé les protéines sur l'homogénat dilué 20 fois, il faut multiplier par 20 pour remonter à la concentration des protéines dans l'homogénat non dilué.

Calcul de l'activité spécifique de la glucose-6-phosphatase en µmole de Pi/h/mg de protéines:
Tenir compte de la prise d'essai d'uniquement 0,4 ml d'homogénat. Combien cela représente en mg de proéines. Si on veut remonter au poids (en g) de foie, il faut aussi tenir compte du rapport poids du foie par volume de tamon d'extraction (10 g de foie dans 100 ml de tampon).
Commentaire:
Théoriquement le nombre d'unité enzymatiques dans le foie du lapin à jeûne est supérieur à celui calculé pour le foie de lapin nourri. Parler du rôle de la néoglucogenèse. Dans la discussion, on peut évoquer des maladies métaboliques comme celle due à un déficit en glucose-6-phosphatase chez l'Homme aboutissant à la maladie de Von Gierke (glycogénose), s'exprimant par une hypoglycémie, acidose lactique,.. La glycogénose type Ia est due à une mutation sur le gène de la glucose-6-phosphatase
Discuter le rôle de la glucose-6-phosphatase comme enzyme intervenant dans la régulation métabolique

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DEFICIT EN GLUCOSE-6-PHOSPHATASE ET GLYCOGENOSES

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Chez l'Homme, une maladie métabolique (maladie de Von Gierke (glycogénose de type I)), est due à un déficit en glucose-6-phosphatase. S'il n'est pas transformé en glucose (par la glucose-6-phosphatase), le glucose-6-phosphate donne le Glucose-1-phosphate qui conduit à la formation excessive du glycogène. D'où l'apparition d'une maladie métabolique appelée Glycogénose. Les glycogénose s'expriment par une hypoglycémie, acidose lactique,.. La glycogénose type Ia est due à une mutation sur le gène de la glucose-6-phosphatase. Les glycogénoses, dues à l'accumulation du glycogène dans le foie et les reins, conduisent aux augmentations des volumes des 2 organes, connues par l'hépatomégalie et la néphromégalie, respectivement.

Il existe plusieurs types de glycogénoses:

L'enzyme G6Pase est située à la face interne de la membrane. Les translocases sont à l'intérieur de la membrane. Le G6P pénètre via T1. Le pyrophosphate pénètre via T2. Le phosphate minéral sort via T2. Le glucose sort via T3

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Aller au QCM du TP glucose-6-phosphatase

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LIENS UTILES DU SITE

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- QCM Métabolisme des glucides
- Biochimie métabolique (métabolisme). Examen S4
- Glycolyse et production d'ATP
- Néoglucogenèse
- Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase (GAPDH)
- QCM métabolisme général
- QCM Chaîne respiratoire
- QCM Néoglucogenèse (TP Métabolisme, S4)
- Glycolysis and gluconeogenesis regulations
- Métabolisme général
- Homéostasie de la glycémie
-تقويم ذاتي مع التوقيت و التنقيط
Contrôle d'autoévaluation, temporisé, noté et commenté

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