Le
dosage des protéines par la méthode de Lowry rentre
dans l'étude quantitative des protéines. Le dosage se
fait à travers une gamme étalon, réalisée
à l'aide de quantités connues de l'albumine de sérum
bovin (SAB).
Dans
le sang, le taux des protéines sériques est constant.
Une variation de ce taux renseigne sur une défaillance fonctionnelle
de l'organisme. Aussi, une variation dans des différents types
de protéines sériques est une conséquence d'une
anomalie pathologique aigue ou chronique. De ce fait, les aspects quantitatif
et qualitatif des protéines
sériques d'un individu renseignent bien sur l'état de
sa santé.
Comme estimés par électrophorèse
sur acétate de cellulose, les taux normaux des différentes
protéines sériques de l'Homme sont:
60% (52%-67%).
Globulines : 40%.
Les globulines se répartissent selon:
- alpha;1-Globulines: 2,4-4,6%
- alpha;2-Globulines: 6,6-14,0%
- beta;-Globulines : 9,0-15,0%
- gamma;-Globulines: 9,0-21,0%
Méthodes colorimétriques
de dosage des protéines
Pour
déterminer la concentration totale de protéines dans un
mélange complexe par spectrophotométrie d'absorption,
des méthodes colorimétriques sont souvent employées.
Ces méthodes sont basées sur la réaction d'agents
chromophores avec les liaisons peptidiques ou avec certains acides aminés
des protéines. Cette réaction donne naissance à
une coloration (dans le visible) dont l'intensité (l'absorbance
(A) ou densité optique (DO)) est directement proportionnelle
à la concentration de la protéine. Les méthodes
colorométriques les plus utilisées pour doser les protéines
sont celles de Biuret, Lowry et Bradford.
Méthode colorimétrique de dosage
par la réaction de Biuret
Gornall
et al. (1949) J. Biol. Chem. 177, 751). En milieu alcalin, les
ions cuivriques se lient par coordination aux atomes d'azote des liaisons
peptidiques des peptides et protéines. La couleur
rose du complexe formé se superpose à la couleur bleue
de la solution cuivrique. La coloration obtenue est violacée.
Le
dosage est réalisé en ajoutant le réactif de biuret,
composé de cuivre (réactif de Gornall, composé
de
1/ Sulfate de cuivre, qui donne la coloration bleu du réactif
due aux ions cuivre, 2/ Solution d'hydroxyde de sodium (soude) à
0,2 mM, qui rend le milieu basique, 3/ Tartrate double de sodium et
de potassium, qui chélate (piège) les ions Cu2+ et évite
leur précipitation en milieu basique sous forme d'hydroxyde de
cuivre Cu(OH)2 insoluble et 4/ Iodure de potassium, pour éviter
la réduction des ions cuivriques avant le dosage). En
milieu alcalin, les ions cuivriques se lient par coordination aux atomes
d'azote des liaisons peptidiques des peptides et protéines.
Ce
complexe est d'autant plus violet (ou mauve)
que la concentration en protéines est élevée. La
longueur d'onde d'absorption du complexe est 540 nm. Un temps
d'attente d'environ 30 min est nécessaire pour le développement
de la couleur.
La
méthode de Biuret est utilisée pour des concentrations
en protéines comprises entre 1 mg/ml et 20 mg/ml.L'ammoniac
et certaines amines peuvent interférer avec ce dosage (eg. tampon
TRIS, sels d'ammonium sulfate). Cette méthode n'est
pas non plus utilisable pour le dosage des glycoprotéines.
Ceci rappelle la réaction de la liqueur de Fehling uttilisée
dans l'identification des sucres réducteurs et qui, elle aussi,
utilise le cuivre. C'est pour cela qu'on recommande une déprotéinisation
préalable à l'identification
des sucres réducteurs d'une solution.
Méthode
colorimétrique de dosage de Folin-Ciocalteu
Cette
technique a été développée par Folin, Ciocâlteu
et Denis. Ce dosage utilise le réactif de Folin (mélange
de tungstate de sodium et de molybdate de sodium en solution dans de
l'acide phosphorique et de l'acide chlorhydrique) qui réagit
spécifiquement avec les acides aminés
aromatiques. Il donne une coloration bleue qui absorbe la lumière
à une longeur d'onde égale à 750 nm.La méthode de Folin-Ciocalteu est utilisée pour le
dosage des protéines avec des concentrations comprises entre
0,1 mg/ml et 1 mg/ml.
Dosage des protéines par
la métode de Lowry Principe
Lowry
et al. (1951) J. Biol. Chem. 193, 251. Le réactif de Folin (acides
phosphotungstique et phosphomolybdique) fut proposé en 1922 par
Wu pour le dosage des protéines, car il donne une coloration
bleue avec certains acides aminés tels que la tyrosine
(Tyr) le tryptophane
(Trp) et lacystéine
(Cys).
En 1951, Lowry et ses collaborateurs rendirent le dosage plus sensible
et moins tributaire de la teneur en tyrosine et tryptophane en effectuant
d'abord un pré-tratement cupro-alcalin des protéines
à doser, s'inspirant de l'ancienne méthode de biuret (complexation
du cuivre avec les liaisons peptidiques donnant une coloration violette
absorbant la lumière à 540 nm). Les ions Cu+ et
les radicaux du Trp, Tyr et Cys réduisent le complexe acide phosphotungstique/acide
phosphomolybdique (couleur jaune) contenu dans le réactif Folin-Ciocalteau
(Na2MoO4 + Na2WO4 + H3PO4), produisant ainsi une couleur bleue
(Cu+ + (F-C)ox ---> Cu2+ + (F-C)red)
Remarque: En général, l'absorbance est mesurée
à des longueurs d'ondes entre 500 nm et 750 nm où
500 nm est considéréee pour le dosage de fortes concentrations
en protéines, alors que 750 nm est adoptée pour le dosage
de faibles concentrations en protéines.
Le traitement cupro-alcalin rappelle la réaction de biuret,
utilisée uniquement quand les concentrations en protéines
sont élevées (1-20 mg/ml). Cependant, la méthode
de Lowry permet de déterminer les concentrations en protéines
comprises entre 0,05 mg/ml et 0,1 mg/ml. Un temps d'incubation
d'environ 30 min est nécessaire pour le développement
de la couleur bleue. Les interférents avec ce dosage sont: K+,
Mg2+, EDTA, phénols, détergents, agents réducteurs.
Réactifs
- Réactif A: Na2CO3
- 2% dans NaOH 0,1 N.
- Réactif B: tartrate de Na et K à 2% dans l'eau.
- Réactif C: CuSO4 5 H2O à 1% dans l'eau
- Réactif D: mélange constitué de 96 ml de réactif
A, 2 ml de réactif B et 2 ml de réactif C (préparé
juste avant l'emploi).
- Réactif E: réactif de Folin-Ciocalteu dilué au
1/3.
- Solution saturée de sulfate d'ammonium ((NH4)2SO4).
- Solution étalon de l'albumine bovine du sang à 0,1 mg/ml
(BSA).
- Solution F : sérum de lapin dilué 100 fois (concentration
protéique inconnue). Mode opératoire Dosage des protéines sériques
totales
- Diluer la solution F 20 fois, sachant qu'on utilisera 1 ml de cette
solution nouvelle (solution G) pour doser les protéines.
- Dosage des globulines sériques
Les globulines sériques sont séparées des albumines
par précipitation au sulfate d'ammonium (relargage). Elles précipitent
à 50% de saturation (voir précipitation
des protéines par le sulfate d'ammonium)
- Dans un tude de centrifugation maintenu dans la glace, introduire
5 ml de solution F.
- Ajouter goutte à goute, 5 ml d'une solution saturée
en sulfate d'ammonium ((NH4)2SO4) tout en agitant lentement le tube
maintenu dans la glace. Laisser précipiter 20 minutes.
- Centrifuger à 9000 g pendant 15 minutes. Le précipité
contient les globulines. Les albumines restent dans le surnageant.
- Eliminer le surnageant et égouter le tube sur du papier filtre.
- Dissoudre le précipité dans 10 ml d'eau distillée
en agitant vigoureusement. On utilisera 1 ml de cette solution (solution
H) pour doser les globulines. Mode opératoire
On réalise le dosage des protéines sur 10 tubes numérotés
0 à 9. Ne contenant pas de protéines, le tube N° 0
est un témoin (blanc). Les tubes 1 à 5 constituent la
gamme-étalon, correspondant à la l'albumine du sérum
bovin de concentration en protéines connue. Les tubes 6 à
9 correspondent aux solutions protéiques G et H, de concentrations
inconnues.
- Exercice spectrophotométrie
- Spectrophotometrie (Viéeo): loi de beer Lambert:
Le
dosage des protéines est éffectué selon le tableau:
- Tracer la courbe de densité optique à 750 nm en fonction
de la quantité de protéines en microgrammes (gamme étalon).
- Déterminer les concentrations des protéines totales
et des globulines dans le sérum de lapin. En déduire la
concentration des albumines sériques.
Méthode colorimétrique
de dosage de Bradford
Bradford,
M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248 - 256. Cette méthode utilise
le bleu de Coomassie (Brilliant Blue G-250) comme réactif
qui réagit (dans des conditions de pH
acide) avec l'Arginine
(Arg) et, dans une moinde mesure, avec l'Histidine
(His), la Lysine
(Lys) et les acides aminés
aromatiques. Le bleu de Coomassie se lie aux protéines par
des interactions non-covalentes (ponts hydrogène, interactions
hydrophobes et interactions ioniques). Sa longueur d'absorption
maximale augmente de 465 nm (rouge) à 595 nm (bleu). le
dosage est peu influencé par la présence d'autres molécules,
sauf les détergents et les bases
fortes. Détection de proteine de 1 µg/ml à
1,5 mg/ml.
Méthode de dosage basée sur la
mesure directe de l'absorbance des résidus d'acides aminés
chromophores : Trp, Tyr et Phe.
A
des pH alcalins, le groupement
phénol (radical R, pK3 = 10,07) des Tyrosines (Tyr) est ionisé
en ion phénolate. Cette ionisation induit une augmentation du
coefficient d'extinction molaire avec un décalage de la longueur
d'onde d'absorbance maximale (lambda = 293 - 297 nm). De ce fait, à
des pH alcalins, on mesure essentiellement l'absorbance des Tyr.
A
pH 7 (neutre), on mesure essentiellement l'absorbance des triptophanes
(Trp) à 277 nm. Le groupement phénol des phénylalanines
(Phe) contribue très peu à l'absorbance globale des protéines.
Précipitation
des protéines au sulfate d'ammonium (relargage)
La
précipitation des protéines par le sulfate d'ammonium
(SA) permet de les fractionner selon leur solubilité.
Cette méthode consiste à ajouter une quantité de
SA dans la solution des protéines de façon à arriver
à un degré (%) de saturation précis (à
la température et au pH de travail). Il s'agit bien du pourcentage
de saturation (donné par des tables) et non pas du pourcentage
de concentration. Grâce à la centrifugation, on peut collecter
(dans le culôt) les protéines précipitées
et on élimine (dans le surnageant) les protéines encore
solubles au degré de saturation en SA défini (protéines
contaminantes). Pour déterminer la quantité de SA à
ajouter on utilise un tableau de saturation.
Exemple:
on vise à récupérer une protéine en solution
dans un volume de 250 ml et qui précipite entre 50% et 75%
de saturation en SA. On procède de cette façon:
1/ Précipiter les protéines entre 0% et 50% de
degré de saturation en SA. En se servant dut tableau ci-dessous,
il faudrait tout ajouter 29.1 g de SA par 100 mL, soit 72,75
g de SA pour 250 ml. L'opération se fait addition dd SA 'petit
à petit' sous agitation et avec la solution des protéines
dans un becher maintenu dans la glace. On laisse précipiter et
on centrifuge. Le culôt est écarté. Le volume du
surnageant est mesuré à l'aide d'une éprouvette.
Supposons que son volume n'a pas changé beaucoup (250 ml).
2/ On ramène le surnageant ( qui est à 50% degré
de saturation en SA) à 75% de saturation en SA. Gâce au
tableau de saturation, on détermine la quantité de SA
à ajouter. Elle est de 15,9 g/100 ml soit 39,75 g/250 ml. On
précipite comme avant et après centrifugation on garde
le culôt cette fois ci et on écarte le surnageant. Tableau simplifié de saturation du sulfate d'ammonium (0°C,
pH 7)
Les
valeurs sont données en termes de % de saturation, c'est-à-dire
en proportion de la quantité de sulfate d'ammonium nécessaire
pour saturer complètement une solution d'eau à pH 7.0
à 0°C (5.35 mol/L) = 706,8 g de SA par litre d'eau. Ce tableau
est simplifié pour des fins d'explication. Le tableau complet
donne des valeurs à tous les 5% de saturation.
Formulae
for ammonium sulphate additions
For
the addition of saturated (NH4)2SO4 solutions, the volume changes on
mixing are negligible. The volume (V) of saturated (NH4)2SO4 (in ml)
which has to be added to 100 ml of solution of initial saturation S1
to produce a final saturation S2 is given by the equation: V = 100(S2-S1)/(1-S2),
with S1 and S2 expressed as fractions of the saturated solution, e.g.
S1 = 0.5 and S2 = 0.7.
