L'enzymologie (étude des enzymes) est l'étude des enzymes (cinétique, mécanismes catalytiques dont l'ordre de fixation des substrats et de libération des produits et détermination des paramètres cinétiques).
La polyphénoloxydase ou PPO, est une oxydo-réductase qui oxyde de substrats de type phénols en présence d'oxygène. Selon quel mécanisme fonctionne-t-elle ?. C'est l'objet de cet examen du parours 'productions végétales' à l'Université Cadi Ayyad, Marrakech, Maroc
EXAMEN
Examen de l'élément de module 'Relation sructure-fonction dans le métabolisme primaire et éléments de base du métabolisme secondaire des plantes', module 'Biochimie, Génétique et Amélioration des Plantes' du Parcours S5 : 'Biologie Appliquée aux Productions Végétales', Novembre 2011, Durée : 1 heure .......... Corrections brèves
QUESTION 1
La polyphnoloxydase (PPO) est une enzyme capable de catalyser l'oxydation des composés phénoliques en présence de l'oxygène moléculaire (O2) pour former des quinones selon la réaction ci dessous. Ces produits peuvent subir ensuite, des polymérisations oxydatives conduisant à la formation de pigments de couleur généralement brune, quelque fois rouge ou bleue.
A. L'activité enzymatique de la PPO de la pomme (Janovitz, 1989, thèse de Doctorat), exprimée en moles d'oxygène consommées par seconde (Katals), a été dosée à 30°C et à pH 4,5, par mesure de la consommation d'oxygène du milieu réactionnel, contenant en plus, un des phénols suivants comme substrat : 4-méthylcatéchol, acide chlorogénique, (+)-catéchine.
Les
cinétiques de chaque réaction, déterminées en faisant varier, à chaque fois, la concentration d'un des deux substrats (Phe ou O2) tout en maintenant l'autre substrat à
concentration constante, ont permis d'obtenir des droites 1/v = f(1/(S)) (représentations de Lineweaver-Burk) correspondant aux diagrammes primaires des figures 1, 2 et 3. Les diagrammes secondaires obtenus avec les points d'intersection des droites avec
l'axe des ordonnées (inverses de vitesses aximales apparentes)
et leurs pentes, sont montrés dans la figure 4.
1. En se basant uniquement sur la cinétique, proposer un ou plusieurs mécanisme(s) de catalyse susceptible(s) de rendre compte de toutes les cinétiques de la PPO de pomme obtenues
avec les trois composés phénoliques substrats. Donner le(s) schéma(s) de Cleland correspondant(s).
B. L'utilisation d'analogues structuraux des phénols, tel que l'acide benzoïque, a permis d'obtenir des cinétiques caractéristiques pour la fixation d'oxygène, comme il est montré dans la figure 5.
2.
Préciser les types d'inhibition exercées par l'acide
benzïque vis-à-vis des substrats 4-Méthylcatéchol
et oxygène. De quels substrat l'acide benzïque est-il
analogue ?. Justifier.
3. Déterminer le mécanisme de catalyse précis
de la PPO de pomme. Proposer un schéma de Cleland. Justifier
votre réponse.
QUESTION
2.
Interpréter brièvement les structures enzymatiques
ci-contre, relatives à la polyphénoloxydase.
Corrections brèves
Question 1:
1. Interprétation des cinétiques
de la PPO de pomme
- Avec 4-méthylcatéchol et O2 comme substrats: Les
diagrammes primaires sont sous formes de faisceaux de droites faisant
intersection à gauche et légèrement en bas de
l'axe des abscisses. Ces cinétiques sont en faveur des mécanismes de catalyse:
1/ Mécanisme
au hasard fixation dépendante
2/ Mécanisme
Séquencé.
- Avec l'acide chlorogénique et O2 comme substrats:
Les mécanismes proposés sont
1/ Mécanisme au
hasard fixation indépendante
2/ Mécanisme séquencé,
car l'intersection des droites se fait sur l'axe des abscisses.
- Avec la catéchine et O2 comme substrats: Les cinétiques
sont en faveur des mécanismes 1/ Mécanisme au hasard
fixation dépendante et 2/ Mécanisme séquencé,
car les droites se coupent à gauche et légèrement
au dessus de l'axe des abscisses.
Les diagrammes secondaires représentés par la figure 4,
montrent que la PPO présente un comportement (affinité)
similaire pour l'oxygène moléculaire. Cependant son
comportement vis à vis du 4-méthylcatéchol est
différent de ceux présentés pour l'acide chlorogénique
et la catéchine.
2.
Interprétation de l'effet de l'acide benzoïque (inhibiteur, analogue de substrat)
- L'acide benzoïque est inhibiteur
compétitif vis à vis du 4-méthylcatéchol.
Ils se fixent sur la même forme d'enzyme. Ils sont, donc, analogues
structuraux.
- L'acide benzoïque est inhibiteur
incompétitif vis à vis de l'oxygène (O2).
Ceci vérifie que l'acide benzoïque ne se fixe plus sur
l'enzyme libre (n'ayant pas fixé l'oxygène au préalable).
Le 4-méthylcatéchol, étant analogue de l'acide
benzoïque, se comporte comme ce dernier en présence de
l'enzyme et de l'oxygène: sa fixation sur l'enzyme est conditionnée
par la fixation de l'Oxygène. Ceci est en faveur d'un mécanisme
de catalyse séquencé manifesté par la PPO de
pomme, avec l'oxygène comme substrat directeur de la catalyse
(se fixe le premier). L'affinité de l'enzyme pour O2 est environ
1/4 mM (= 0,25 mM). La vitesse maximale en présence du 4-méthylcatéchol
est d'environ 0,25 µKat/ml
Question 2:
La PPO est une enzyme à cuivre (Cu++, métalloenzyme). Il existe deux atomes de cuivre par molécules (chaîne). Chaque atome de cuivre est coordonnée par 3 histidines différentes. L'oxygène (substrat directeur) réagirait avec le cuivre. Il se placerait entre les deux atomes de cuivre. Le deuxième substrat (composé phénolique) est attiré vers la poche catalytique suite à son interaction hydrophobe avec la Phénylalanine (Phe261). Les deux éléments se rapprochent l'un à l'autre par leurs noyaux 'benzène'. ------> voir structure 3D de l'enzyme polyphenoloxydase (PPO) par JMOL.
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