Chromatographie sur couche mince (CCM). Séparation des lipides selon le caractère de la polarité

CCM, TLC, كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة TP. EXTRACTION DES LIPIDES VIDEO DU TP LIENS UTILES

chromatographie couche mince (ccm). Application aux lipides (TP)
كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة. تطبيق في الدهون

Une partie du travail pratique (TP) lipides de S3 porte sur la séparation des lipides par chromatographie couche mince (ccm). La CCM exploite le critère de la polarité des molécules. Les composés polaires sont plus solubles dans des solvants polaires qu'ils ne l'ont dans des des solvants non polaires.

فصل الدهنيات المختلفة عن طريق كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة
Séparation des lipids par chromatographie sur couche mince
في هذا الشغل التطبيقي، سنعتمد خاصية القطبية (Polarité) في فصل دهنيات مختلفة مستخلصة من بذور عباد الشمس (Tournesol) بواسطة مذيبات مختلفة. نستعمل في ذلك تقنية الكروماتوغرافيا فوق الطبقة الرقيقة (Chromatographie sur couche mince (CCM) ou Thin layer chromatography (TLC), en Anglais ).
أساس عملية ال عزل بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة يرتكز على انتشار مكونات العينة بين طوريين، الطور الثابت (Phase statonnaire) والطور السائل المتحرك (Phase mobile)، حيث ترتبط مكونات العينة بمادة الادمصاص (adsorption) عن طريق القوى القطبية، أساسا. عند استخدام مذيبات غيرقطبية كطور متحرك، ترتبط (تدمص) مكونات العينة القطبية على الطور الثابت (مادة الادمصاص) وبذلك تنفصل المركبات الغيرقطبية عن المركبات القطبية. والعكس صحيح.

Dans ce travail pratique, on exploite le critère de la polarité des molecules dans la separation des lipides extraits à partir du tournesol par différents solvants. Dans ce but, on utilise la technique de chromatographie sur couche mince (CCM) (thin layer chromatography, en Anglais).
Le principe de la chromatographie sur couche mince repose sur la dispersion des molécules de l'échantillon sur deux phases, une phase stationnaire (fixe) et une phase mobile. Les constituants de l'échantillon se fixent sur la matière d'adsorption selon leurs forces liées essentiellement à la polarité.
Lors de l'utilisation de solvants apolaires comme phase mobile, les constituants polaires de l'échantillon s'adsorbent sur la phase stationnaire permettant aux composés apolaires d'être détachés et séparés sur le support de migration.

تعد عملية فصل الدهنيات بتقنية كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة من اسهل الطرق وأسرعها ويتم فيها استخدام الألواح الزجاجية المغطاة بطبقة رقيقة من هلام السيليس (سلكا جل، silicagel) الذي يشكل الطور الثابت. يختلف سمك طبقة السلكا جل باختلاف أهداف التجربة. تستخدم مذيبات متعددة في الطور المتحرك لفصل المركبات الدهنية، حيث تختلف وفق درجة القطبية (Degré de polarité) طبقا للمواد المراد فصلها. كمثل لذلك، نذكر Chloroforme:Méthanol:Acide acétique glacial:Eau (60:50:1 :4 v/v)، الذي يصلح لفصل الفسفودهنيات. من الممكن استخدام مذيبات أخرى (أغلبها غير قطبية) وبنسب مختلفة. لكن إضافة نسبة قليلة من المذيبات الأكثرقطبية مثل حمض الخليك أو الماء تهيئ حالة مثلى لفصل الفسفودهنيات والجلسريدات الأحادية والأحماض الدهنية. تعزى قطبية الدهنيات إلى الروابط المزدوجة وموقعها بين ذرات الكاربون والوضع الفراغي وكذلك عدد المجاميع القطبية ودرجة قطبيتها ووضعا Cis-Trans.

La séparation des lipides par chromatographie sur couche mince est une technique facile et rapide à exécuter. Elle utilise des plaques de verre couvertes par une couche mince de gel de silice (silicagel) qui constitue la phase stationnaire. L'épaisseur du gel dépend du but de l'expérience. La phase mobile utilisée dans la séparation des lipides est constituée de variétés de solvants différant par leur degré de polarité et adaptés aux molécules à séparer. Comme exemple, on donne le mélange Chloroforme:Méthanol:Acide acétique glacial:Eau (60:50:1 :4 v/v) adapté à la séparation des phospholipides. Il est possible d'ajouter aux mélanges de petits volumes de solvants plus polaires comme l'acide acétique et l'eau pour séparer les phospholipides, les monoglycérides et les acides gras.

ترتب المذيبات العضوية المستخدمة في عملية الفصل حسب القطبية من الأقل إلى الأكثر قطبية:

Polarité croissante des solvants: Eher de pétrole < Cyclohexane < Tétrachlorure de carbone < Benzène < Toluène < Dichlorométhane < Ether diéthylique < Chloroforme < Acétate d'éthyle < Pyridine < Acétone < Ethanol < Méthanol < Eau < Acide acétique.

مميزات كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

طريقة سريعة تحتاج من 20 حتى 40 دقيقة
تستخدم كميات قليلة من المادة المراد فصلها
عملية الفصل واضحة وحادة
تستعمل أنواع عديدة من السلكا جل مع إمكانية توسيع سعة اللوح عن طريق زيادة سمك الطبقة التي تغطيه
طريقة غير مكلفة ولا تحتاج إلى مهارة فائقة

Caractéristiques de la CCM:
- Rapide, exigeant 20-40 minutes
- Utilise des quantités faibles d'extrait à séparer
- Séparation nette et fine
- Utilise plusieurs types de silicagel, avec possibilité d'étendre la capacité de la plaque en augmentant l'épaisseur de la couche sur la plaque
- Technique non coûteuse et n'exige pas de qualification technique supérieure.

Extraction des lipides du tournesol

- Décortiquer 20 graines de tournesol à répartrir sur deux motier à raison de 10 graines par mortier.
- Ajouter 10 ml d'hexane dans le premier mortier et 10 ml du mélange de Folch (Chloroforme:Méthanol (2 :1)) dans le deuxième mortier.
- Broyer pendant 10 minutes et transvaser le contenu de chaque mortier dans dans un microtube de 1,5 ml.
- Centrifuger les tubes pendant 10 minutes à 5000 g. Le surnageant de chaque tube constitue l'extrait de lipides solubilisés par le solvant défini. Les extraits à l'héxane et au Folch sont notés H et F, respectivement.
La séparation des lipides extraits par chromatographie sur couche mince sera faite sur des plaques en verre tapissées d'une couche fine de silice.
- En évitant de toucher la silice avec les doigts, tracer, à 3 centimètres du bord inférieur de la plaque, une ligne droite sans décoller la silice. Marquer sur cette ligne quatre points de dépôt séparés par une distance de 1 cm.
- A l'aide d'une seringue, déposer au niveau des repères marqués H et F sur la ligne de dépôt, une goutte de chaque extrait lipidique correspondant (une goutte par point de dépôt). Sur les deux repères marqués S et PL, déposer séparemment une goutte de lipide témoin (cholestérol pour les stérols (S) et un pohospholipide (PL)). Utiliser des seringues différentes correspondant à chacun des extraits et des témoins.
- Placer les plaques dans la cuve de développement contenant le chloroforme comme phase mobile. Laisser migrer la phase mobile jusqu'à 3 cm du bord supérieur de la plaque.

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- A la fin de la migration, retirer la plaque de la cuve et la laisser sécher pendant 15 minutes.
- Afin de révéler les lipides, placer la plaque de chromatographie dans une cuve de révélation saturées avec la vapeur d'iode. Laisser incuber 20 minutes
- A l'aide d'un crayon, entourer les spots correspondant aux différents lipides.
Questions :
- Reproduire sur une feuille le chromatogramme obtenu et identifier les différents composés séparés pour les deux extraits lipidiques.
- Donner une comparaison sur l'effet de chaque solvant ou mélange de solvants utilisés dans l'extraction des lipides des graines de tournesol.

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Vidéo TP chromatographie sur couche mince:

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