biochimie. Cours, techniques d'analyse et applications en biotechnologies
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Techniques d'analyse des protéines. Exercices

Après leur extraction, les protéines sont analysées par des techniques de séparation variées dont l'électrophorèse et la chromatographie.


Protéines. Q1 (Réponse 1). Parmi les propsitions suivantes, lesquelles sont fausses ?

a: le pI est la valeur de pH pour laquelle une protéine n'a pas de charge.
b: à une valeur de pH égale à son pI, une protéine ne migre pas dans un champs électrique au cours d'une électrophorèse.
c: une protéine acide aura un pI plus grand que 7,0.

d: une protéine basique aura un pI plus grand que 7,0.

Protéines. Q2 (Réponse 2) . Les 5 protéines dont les masses moléculaires et les points isoélectriques sont donnés ci-dessous, sont séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (une des techniques de séparation très utilisée) en présence de SDS. Donner l'ordre de leur migration du sommet (le point de dépôt des échantillons) à la partie inférieure du gel.

a: alpha-Antitrypsine (PM: 45000, pI: 5,4),
b: Cytochrom c (PM: 13400, pI: 10,6),
c: Myoglobine (PM: 17000, pI: 7,0),

d: Albumine sérique (PM: 69000, pI: 4,8),
e: Transferrine (PM: 90000, pI: 5,9).

Protéines. Q3 (Réponse 3). Si les 5 protéines de Q2 sont séparées par isoélectrofocalisation, quelle pourrait être leur distribution entre les extrémités positive (anode,+) et négative (cathode, -) du gel ? Donner les valeurs les plus hautes et les plus faibles de pH.


Protéines. Q4 (Réponse 4) . La séparation des peptides P (Lys-Gly-Ala-Gly), Q (Lys-Gly-Ala-Glu) et R (His-Gly-Ala-Glu) a été effectuée par électrophorèse sur papier réalisée à différents pH. Quelle serait la direction de migration (A: vers l'anode, C: vers cahode et O: immobile) pour ces peptides aux valeurs de pH données:

a: pH=2,0,
b: pH=4,0,
c: pH=6,0,
d: pH=11,0.

Protéines. Q5 (Réponse 5). Associer les critère de séparation Taille (T), Charge électrique, (C), Liaison spécifique (L) et Solubilité (S) à une ou plusieurs méthodes de séparations suivantes:

a: électrophorèse.
b: Chromatographie d'exclusion (ge-filtration).
c: Relargage par sels (salting out).
d: Immunoprecipitation.
e: Isoélectrofocalisation.
f: Chromatographie d'affinité.
g: Chromatographie d'échange d'ions.
h: Ultracentrifugation de zone.

Electrophorgelèse sur

Chromatographie


Protéines. Q6 (Réponse 6). Parmi les techniques de séparation et d'analyse suivantes préciser celles qui sont utilisées pour localiser les ponts dissulfure dans une protéine:

a: Réduction préalable suivie de carboxyméthylation de la protéine.
b: clivage de la protéine par hydrolyse acide.
c: Clivage spécifique maintenant les ponts dissulfure intacts.
d: séparation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS des différents peptides.
e: Séparation des peptides par électrophorèse bidimensionnelle, un traitement par acide performique s'intercalant entre la 1ere. et la 2eme. dimension.



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Protéines et Enzymes, Baaziz 2013


Protéines. Q7 (Réponse 7). Un mélange d'acides aminés est séparé par chromatographie de partage à pH 6,0. Les intérprétations suivantes sont-elles vraies ou fausses (V/F) ?

1/ Val migre plus loin que Ser.
2/
Gln migre plus loin que Asn.
3/ Phe migre plus loin que Val.
4/ Lys migre plus loin que Ileu.
5/
Asp migre plus loin que Ala.


Protéines. Q8 (Réponse 8). L'électrophorèse des protéines du sérum d'un individu sain et d'un individu malade (infection bactérienne ou virale (VIH, hépatite), autoimmunité) a été réalisée à pH très basique (pH 8-9). L'électrophorégramme est représenté par la figure ci dessous. Expliquer le principe de la séparation par électrophorèse des globulines et de l'albumine dans les deux situations différentes.

Protéines sérum. Electrophorèse


- Alpha 1-globulines: a1-lipoprotéine (ex: HDL (= 'bon cholestérol') de PM: 390 kDa), a1-antitrypsine (PM: 55 kDa), a1-antichymotrypsine, transcortine (PM: 49,5 kDa), orosomucoïde (a1-glycoprotéine acide, 40 kDa), globuline liant la thyroxine, prothrombine. La protéine majeure est l'alpha 1-antitrypsine.
- Alpha 2-globulines: a2-macroglobuline (glycoprotéine, PM: 850 kDa), haptoglobine (très riche en glucides, PM: 86-160 kDa pour formes monomériques), céruléoplasmine (a2-glycoprotéine, PM: 150 kDa), Choline-estérase, plasminogène, antithrombine III, protéine liant le rétinol et protéine liant la vitamine D. La protéine majeure est l'alpha 2-macroglobuline.
- Béta-globulines: bêta-lipoprotéine (LDL de PM 2500 kDa), transferrine (PM: 90 kDa), hémopexine (glycoprotéine, PM: 80 kDa), facteur C3 du complément (PM: 200 kDa), ß 2-microglobuline, fibrinogène (peut être dans la zone gamma, aussi), globuline liant les stéroïdes sexuels, transcobalamine, Protéine C réactive (en interzone Béta-Gamma, CRP). Les protéines majeures sont la béta-lipoprotéines (LDL = 'mauvais cholestérol'), le facteur C3 du complément et la transferrine.
- Poids moléculaires des gammaglobulines (immunoglobulines, Ig): variable selon le types des Ig. Exemples IgG (85% des ig sériques): 150 kDa, IgA: 160-400 kDa et IgM: 900 kDa (+ IgD: 185 kDa et IgE: 190 kD). Cette zone contient aussi, le lysozyme, le fibrinogène et la protéine C-réactive.

Réponses brèves


Protéines. Réponse à Q1 (Question 1). a, c. Quel que soit le pH, une protéine n'est jamais dépourvue de charge électrique. A son pI, la somme de toutes les charges est égale à zéro. Une protéine acide aura un pI plus petit que 7,0 au lieu de plus grand que 7,0.


Protéines. Réponse à Q2 (Question 2). Sommet: e, d, a, c, b partie inférieure. La séparation est réalisée en fonction de la taille des molécules (PM)

Protéines. Réponse à Q3 (Question 3). pH élevé (-) b, c, e, a, d pH faible (+). L'isoélectrofocalisation (IEF) sépare les protéines en fonction de leurs valeurs de PI.


Protéines. Réponse à Q4 (Question 4). Pour préciser la charge électrique d'un peptide à un pH déterminé, il faut connaître son PI.

- a: P (C), Q (C), R (C);
- b: P (C), Q (C), R (C);
- c: P (C), Q (O), R (A);
- d: P (A), Q (A), R (A).

- Par exemple, à pH 2,0, le peptide Q porte une charge nette de +1,5 (chaîne latérale Lys: +1; groupement alpha-aminé: +1, chaîne latérale Glu: 0 et groupement carboxyle terminal: -0,5, puisque le pH coïncide avec sa valeur de pK).

- A pH 4,0, la charge nette est +0,5; la chaîne latérale de Glu est à demi-ionisée (-0,5), mais le carboxyle terminal est presque complètement ionisé (-1).

Isoélectrofocalisation. PI, PM


peptide Lys-Gly-Ala-Glu

- A pH 6,0, la charge nette est 0 due à une charge +2 apportée par le résidu Lys et une charge -2 apportée par le résidu Glu.

- A pH 11,0, le groupement alpha-aminé est déprotoné (charge 0) et la chaîne latérale Lys est à demi-protonée (charge +0,5); la charge nette est donc de -1,5.


Protéines. Réponse à Q5 (Question 5 ). a: T, C, b: T, c: S, C d: L, e: C, f: L, g: C, h: T.


Protéines. Réponse à Q6 (Question 6). Un pont disulfure (pont S-S) est une liaison covalente qui se forme par oxydation dans les protéines, de manière post-traductionnelle. Le cytoplasme n'étant pas un milieu oxydant, il y a trés peu de protéines intracellulaires qui possèdent des ponts disulfure.

Réponses: c, e. L'acide performique oxyde les liaisons disulfure en groupement SO(3-) et libère de nouveaux peptides. La protéine contenant des ponts S-S est hydrolysée. L'hydrolysat est soumis à une première électrophorèse (Dimension 1). Le papier ayant servi de support d'électrophorèse en première dimension est traité avec la vapeur de l'acide performique qui oxyde tous les ponts S-S. Il est ensuite découpé et soumis à une autre électrophorèse dans les mêmes conditions (dimension 2). Les peptides qui contiennent des ponts S-S se répliquent en plusieurs autres peptides, contrairement à ceux qui ne contiennent pas de ponts S-S.


Protéines. Réponse à Q7 (Question 7). La chromatographie de partage exploite le critère de la polarité dans la séparation des molécules. La chromatographie sur papier est un exemple.

1/ (Vrai). La Val possède une chaîne carbonnée non polaire. La Ser est un acide aminé polaire hydroxylé (hydroxyle sur C béta).
2/ (Vrai). Gln (pHi = 5,65) et Asn (pHi = 5,41) ne sont pas chargés à pH 6,0 (car pHi proche de 6). Ce sont des acides aminés polaires. Néanmoins, la Gln possède un squelette carbonné plus long que celui de Asn et sera entraîné un peu plus loin.
3/
(Vrai). Phe est un acide aminé aromatique (acide aminé cyclique) à caractère hydrophobe marqué. Val est un acide aminé non polaire mais moins hydrophobe que Phe. Hydrophobicité croissante: Ala-Met-Cys-Phe-Leu-Val-Ile
4/ (Faux). Lys (pHi = 9,59) sera chargée positivement à pH 6,0. Elle sera retenue par la phase stationnaire. Quant à Ileu (acide aminé non polaire, très hydrophobe), elle sera entraîné par la phase mobile.
5/
(Faux). Asp (pHi = 2,77) est un acide aminé chargé négativement à pH 6,0. Ala est un acide aminé non polaire. Asp sera retenu par la phase stationnaire (polaire) alors que Ala sera entraîné par la phase organique.


Protéines. Réponse à Q8 (Question 8). Selon le principe de la séparation des protéines par électrophorèse, les critères moléculaires exploités par cette technique résident dans la charge électrique (liée au point isoélectrique (PI) ou pH isoionique (pHi)) et la taille ou poids des molécules (masse molaire). De façon plus simplifiée, la mobilité électrophorétique d'une molécule soumise à l'électrophorèse à pH déterminé (pH) peut-être exprimée par la relation :
Mobilité = k . (pH - pI) / masse molaire, où pI est le point isoélectrique de la molécule.

En considérant le pH basique (pH = 8-9) de l'électrophorèse et le fait que l'albumine du sérum présente le PI (PI = 4,7) et le poids moléculaire (PM = 67 kDa) les plus petits par rapport aux globulines, elle migre rapidement vers l'anode (+), car chargée très négativement à pH basique (voir effet du pH sur l'acquisition des charges électriques des acides aminés et des protéines).

Les globulines ayant des PI (alpha: PI = 5,1, béta: PI = 5,6 et gamma: PI = 6,0) supérieurs par rapport à celui de l'albumine (PI = 4,7) et présentant globalement des poids moléculaires élevés, migrent moins vite vers l'anode.

Attention, concernant l'albumine, les recherches scientifiques ont montré que la forme (form, shape, شكل) peut intervenir dans la séparation par électrophorèse. Ainsi la SAB peut présenter des changements de conformation spatiale (isomérisation) en fonction du pH, qui peuvent être attribués à des ruptures d’interactions de type ionique suite au changement de pH. En particulier, un pH de 4,3 marque une transition entre la forme native (N) de la protéine et la forme « fast » (F) pour laquelle une diminution des structures en hélice est observée (Carter, Carter, D.C. and Ho, J.X., Structure of serum albumin. Adv Protein Chem, 1994. vol.45: p. 153-203). Avec la diminution du pH, la structure est de plus en plus étirée.

albumine. Formes E, F, N, B

Pour d'autres molécules comme les acides nucléiques (chargés négativement par le phosphate) et plus particulièrement pour les plasmides, la séparation par électrophorèse peut être influencée par la forme des molécules.

Toutes les varaiations qualitatives et quantitatives montrées par l'électrophorégramme des protéines sériques reflètent l'état de santé des individus correspondants. Ainsi, l'Albumine et les globulines alpha 1, alpha2 et béta, toutes synthétisées au niveau du foie renseignent sur la santé de cet organe. Les globulines gamma (immunoglobulines), élaborées par les lymphocytes B activées reflètent l'état du système immunitaire humoral.

L'état de santé et la prise de médicaments peuvent changer la mobilité de l'albumine. Ainsi l'aspirine et la pénicilline entraient une augmentation de la mobilité de l'albumine.

Les diverses immunoglobulines (gammaglobulines) peuvent migrer de la zone alpha1 à la zone gamma, mais se retrouvant principalement dans cette dernière zone, particulièrement les immunoglobulines de type G (IgG). les IgA (PM = 180 kDa) et les IgM de PM égal à 970 kDa (plus rarement les IgG de PM 150 kDa) peuvent migrer dans les fractions alpha2, béta1 et béta2 plutôt que dans la zone gamma. La forme arrondie de la zone gamma du profil densitométrique résulte de la contribution de millions de formes clonales d’immunoglobulines ayant une séquence et des propriétés leur conférant une mobilité électrophorétique différente, chacune provenant d’un groupe restreint de plasmocytes. La prolifération anormale d’un seul de ces clones dans le cadre d’une gammapathie monoclonale se traduit par un excès relatif de l’immunoglobuline spécifique que le clone produit. Ceci génère un pic distinct à l’électrophorèse. Attention, une gammapathie monoclonale de signification indéterminée présente un risque d’évolution vers un myélome.


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Protéines. Electrophorèse